In This Article

Summary

В этом анализе используются эмбриональные стволовые клетки мыши, дифференцированные в эмбриоидные тела, культивируемые в геле 3D-коллагена, для анализа биологических процессов, которые контролируют прорастающий ангиогенез in vitro. Методика может быть применена для тестирования лекарств, моделирования заболеваний, а также для изучения конкретных генов в контексте делеций, которые являются эмбрионально летальными.

Abstract

Последние достижения в области индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и технологий редактирования генов позволяют разрабатывать новые модели заболеваний на основе клеток человека для программ открытия фенотипических лекарств (PDD). Хотя эти новые устройства могут более точно предсказывать безопасность и эффективность исследуемых препаратов на людях, их разработка в клинике по-прежнему в значительной степени зависит от данных о млекопитающих, в частности, от использования моделей болезней мышей. Таким образом, параллельно с моделями заболеваний органоидов человека или «орган-на-чипе» разработка соответствующих моделей мышей in vitro является неудовлетворенной потребностью для оценки прямых сравнений эффективности и безопасности лекарств между видами и в условиях in vivo и in vitro . Здесь описан анализ прорастания сосудов, в котором используются эмбриональные стволовые клетки мыши, дифференцированные в эмбриоидные тела (БЭ). Васкуляризированные БЭ, культивируемые на 3D-коллагеновом геле, развивают новые кровеносные сосуды, которые расширяются, процесс, называемый прорастающим ангиогенезом. Эта модель резюмирует ключевые особенности прорастающего ангиогенеза in vivo - образования кровеносных сосудов из ранее существовавшей сосудистой сети, включая отбор клеток кончика эндотелия, миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, управление клетками, формирование трубок и рекрутирование клеток фремиссии. Он поддается скринингу на лекарства и гены, модулирующие ангиогенез, и показывает сходство с недавно описанными трехмерными (3D) сосудистыми анализами, основанными на технологиях iPSC человека.

Introduction

За последние три десятилетия открытие лекарств на основе мишеней (TDD) широко использовалось фармацевтической промышленностью при открытии лекарств. TDD включает в себя определенную молекулярную мишень, играющую важную роль в заболевании, и опирается на разработку относительно простых систем клеточных культур и считывания для скрининга лекарств1. Наиболее типичные модели заболеваний, используемые в программах TDD, включают традиционные методы культивирования клеток, такие как раковые клетки или иммортализированные клеточные линии, выращенные в искусственных средах и нефизиологических субстратах. Несмотря на то, что многие из этих моделей предоставили жизнеспособные инструменты для выявления успешных кандидатов на лекарства, использование таких систем может быть сомнительным из-за их низкой актуальности для болезней2.

Для большинства заболеваний основные механизмы действительно сложны, и часто обнаруживается, что различные типы клеток, независимые сигнальные пути и несколько наборов генов способствуют определенному фенотипу заболевания. Это также верно для наследственных заболеваний, где основной причиной является мутация в одном гене. С недавним появлением технологий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC) и инструментов редактирования генов теперь можно создавать 3D-органоиды и модели заболеваний органов на чипе, которые могли бы лучше повторять сложность человека in vivo 3,4. Развитие таких технологий связано с возрождением интереса к программам открытия фенотипических лекарств (PDD)1. PDD можно сравнить с эмпирическим скринингом, поскольку они не опираются на знание идентичности конкретной лекарственной мишени или гипотезу о ее роли в заболевании. В настоящее время все шире признается, что подход PDD вносит значительный вклад в открытие первых в своем классе лекарств5. Поскольку развитие технологий органоидов человека и «органов-на-чипе» все еще находится в зачаточном состоянии, ожидается, что модели iPSC (дополненные инновационными инструментами визуализации и машинного обучения6,7) предоставят в ближайшем будущем несколько новых сложных моделей клеточных заболеваний для скрининга лекарств и связанных с ними программ PDD для преодоления низкой производительности подхода TDD8, 9.

В то время как модели органоидов человека и «орган-на-чипе» могут дать важную информацию о сложности заболевания и идентификации новых лекарств, внедрение лекарств в новую клиническую практику также в значительной степени зависит от данных животных моделей для оценки их эффективности и безопасности. Среди них генетически модифицированные мыши, безусловно, являются наиболее предпочтительными моделями млекопитающих. У них есть много преимуществ, поскольку они имеют относительно короткое время генерации для млекопитающих, имеют много схожих фенотипов с болезнями человека и могут быть легко генетически манипулированы. Поэтому они широко используются в программах по открытию лекарств10. Тем не менее, преодоление разрыва между мышами и людьми остается важной задачей11. Разработка моделей мышей in vitro, эквивалентных человеческим органоидам и моделям «орган-на-чипе», может, по крайней мере, частично восполнить этот пробел, поскольку это позволит проводить прямые сравнения эффективности и безопасности лекарств между данными о мышах in vivo и людях in vitro .

Здесь описан анализ прорастания сосудов в эмбриоидных телах мышей (БЭ). Кровеносные сосуды состоят из эндотелиальных клеток (внутренняя оболочка стенок сосудов), клеток стенки (клетки гладких мышц сосудов и перициты)12. Этот протокол основан на дифференцировке мышиных эмбриональных стволовых клеток (мЭСК) в васкуляризированные БЭ с использованием висячих капель, которые повторяют de novo эндотелиальные клетки и дифференцировку клеток фрески13,14. ЭСК мышей могут быть легко установлены в культуре из изолированных бластоцист мыши на 3,5-й день, имеющих различный генетический фон15. Они также предоставляют возможности для клонального анализа, отслеживания происхождения и могут быть легко генетически обработаны для создания моделей заболеваний13,16.

Поскольку кровеносные сосуды питают все органы, неудивительно, что многие заболевания, если не все, связаны с изменениями в микроциркуляторном русле. При патологических состояниях эндотелиальные клетки могут принимать активированное состояние или могут стать дисфункциональными, что приводит к гибели клеток или миграции из кровеносных сосудов. Это может привести к чрезмерному ангиогенезу или разрежению сосудов, может вызвать аномальный кровоток и дефектный барьер кровеносных сосудов, что приводит к экстравазации иммунных клеток и воспалению12,17,18,19. Таким образом, исследования по разработке лекарств, модулирующих кровеносные сосуды, высоки, и уже было выявлено множество молекулярных игроков и концепций для терапевтического нацеливания. В этом контексте описанный протокол особенно подходит для построения моделей заболеваний и для тестирования лекарств, поскольку он повторяет ключевые особенности ангиогенеза прорастания in vivo, включая отбор эндотелиальных клеток кончика и стебля, миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, руководство эндотелиальными клетками, формирование трубок и рекрутирование клеток фремиссии. Он также демонстрирует сходство с недавно описанными 3D-сосудистыми анализами, основанными на технологиях iPSCчеловека 20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. Медиаподготовка и культура mESC

  1. Приготовьте кондиционированную среду +/- (CM+/-), используя добавку 1x среда Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) с 10% (об./об.) инактивированной теплом фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,05 мМ β-меркаптоэтанола, 1x заменимых аминокислот (NEAA 1x), 2 мМ L-глутамина и 1 мМ пирувата натрия.
  2. Приготовьте кондиционированную среду +/+ (CM+/+) с использованием добавки CM+/- среды с фактором ингибирования лейкемии (LIF) (1,500 ЕД/мл) и 0.1 мМ β-меркаптоэтанола.
  3. Приготовьте кондиционированную среду +/+ в присутствии двух ингибиторов (CM+/+ 2i) с использованием добавки CM+/+ среды с 1 мкМ PD0325901 и 3 мкМ CHIR99021.
  4. Приготовьте 0,1% раствор желатина, смешав 25 мл предварительно подогретого 2% раствора желатина с 500 мл фосфатно-буферного физиологического раствора без кальция и магния (DPBS).
  5. Приготовьте 10-кратный буфер трипсина и версенфосфата (TVP 10x), смешав трипсин (2,5%) с TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 мМ ЭДТА, 0,01% куриной сыворотки, 0,01% трипсина (2,5%) в H2O) (соотношение 1:10, объем/об.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отфильтруйте все растворы через поровый фильтр 0,22 мкм. Храните питательную среду при температуре -20 °C в течение длительного времени, а другие реагенты храните при температуре 4 °C до 3 недель (см. Таблицу материалов).
  6. Покройте две 12-луночные пластины для культивирования клеток 0,1% раствором желатина (500 мкл на лунку) и инкубируйте их в течение 30 мин в инкубаторе CO 2 (37 °C, 5% CO2, влажная атмосфера).
  7. Вымойте пластины с желатиновым покрытием PBS и добавьте 500 мкл среды CM+/-.
  8. Разморозьте два флакона по 1 x 106 криоконсервированных облученных эмбриональных фибробластов мыши (MEF) при 37 ° C и перенесите клеточную суспензию в коническую трубку с 5 мл среды CM +/-.
  9. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Аспирируют среду и осторожно ресуспендируют клеточную гранулу в 12 мл среды CM+/- в концентрации 1,67 х10,5 клеток на мл.
  10. Высевают 500 мкл суспензии MEF в 12-луночную клеточную культуральную пластину (2,4 x 10,5 клеток на см 2 ) и инкубируют пластину в течение ночи (o / n) в инкубаторе CO 2.
  11. Разморозьте один флакон криоконсервированных мЭСК (1 x 106) в среде CM+/+ 2i.
  12. Засейте суспензию mESC на предварительно промытую 12-луночную пластину с MEF в 1 мл среды CM+/+ 2i и перенесите планшет в инкубатор CO2 . Ежедневно обновляйте средство.
  13. При слиянии 70% промойте колонии mESC с помощью DPBS. Добавьте 150 мкл теплого 10-кратного буфера TVP и инкубируйте при RT в течение 30 с, чтобы инициировать ферментативную диссоциацию.
  14. Осторожно удалите буфер TVP, ресуспендируйте клетки в 1 мл среды CM+/+ 2i и диссоциируйте колонии на отдельные клетки путем осторожного пипетирования.
  15. Пропустите клетки, перенеся их на новую 12-луночную пластину для культивирования клеток с MEF (коэффициент расщепления: 1:3-1:5). Аккуратно перемешайте, чтобы распределить клетки и инкубировать в инкубаторе CO2 .
  16. Освежите питательную среду (2-3 мл) и ежедневно наблюдайте за ростом/морфологией клеток. Повторяйте последовательное прохождение с 70% слиянием каждые 2 дня. Переключитесь на среду CM+/+ в течение двух пассажей, прежде чем начать дифференцировку клеток.

2. Формирование ЭБ в висячей капле

  1. Приготовьте свежую среду для дифференцировки мезодермы, дополнив среду CM+/- основным фактором роста фибробластов (bFGF) (50 нг·мл-1) и костным морфогенетическим белком 4 (BMP-4) (5 нг·мл-1) и держите его при температуре 4 °C до использования.
  2. Покройте одну лунку 6-луночного планшета для культивирования клеток 500 мкл 0,1% раствора желатина и поместите его в инкубатор CO2 на 30 мин.
  3. Вымойте пластины с желатиновым покрытием PBS и добавьте 500 мкл среды CM+/-.
  4. Чтобы получить чистую популяцию мЭСК, трипсинизируют пластину для культивирования клеток 10-кратным буфером TVP в течение 30 с при ЛТ, ресуспендируют клетки в среде дифференцировки мезодермы объемом 1 мл, а затем переносят их в 6-луночную пластину, покрытую желатином, в течение 30 мин, позволяя МЭФ прикрепляться, пока мЭСК остаются в суспензии.
  5. Соберите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра Нойбауэра и красителя трипанового синего для исключения живых/мертвых клеток.
  6. Центрифугируют клетки при 200 x g в течение 5 мин при RT. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в среде дифференцировки мезодермы до достижения 4,55 x 104 клеток на мл.
  7. Наполните дно посуды из полистирола с низкой насадкой 94 мм 15 мл стерильной воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре чашки с висячими каплями (1,6 x 105 клеток в 3,52 мл среды) потребуются для тестирования одного конкретного состояния с использованием 3D-анализа прорастающего ангиогенеза.
  8. Перенесите клеточную суспензию в стерильный пластиковый резервуар и загрузите в четыре положения многоканальной пипетки 22 мкл клеточной суспензии на канал (1 x10,3 клетки на 22 мкл капли).
  9. Поднимите и переверните крышку посуды диаметром 94 мм и поставьте ее на чистую поверхность шкафа внутренней стороной вверх.
  10. Нанесите 40 капель клеточной суспензии на внутреннюю поверхность каждой крышки. Осторожно переверните крышку без помех и положите ее обратно на блюдо так, чтобы капли были обращены к воде.
  11. Инкубируйте посуду в инкубаторе CO2 . Считайте, что это день дифференциации 0. Выдерживайте пластины в течение 4 дней до образования ЭБ.

3. Конкурсный анализ положения ячейки наконечника

  1. Культивируют одну флуоресцентную и одну нефлуоресцентную линию mESC, как описаноранее 13. В качестве примера используются мЭСК 7ACS/EYFP, помеченные желтым цветом, и мЭСК R1.
  2. Приготовьте мозаичные ЭБ, смешав равные количества двух линий mESC (соотношение 1:1), и инкубируйте подвесные чашки в инкубаторе CO 2, как описано на шаге2 .

4. Плавающая культура БЭ для дифференцировки сосудов

  1. Перед сбором ЭБ из висячих капель подготовьте следующее.
    1. Приготовьте 5% раствор агара вН2О и стерилизуйте его автоклавированием (20 мин при 120 °С).
    2. Используйте теплый 5% раствор агара для приготовления среды G-MEM BHK-21, содержащей 1% агара, и быстро налейте 3 мл в одну из 60-миллиметровых полистирольных посуд. Дайте агару застыть в течение 1 часа при RT. Храните посуду при температуре 4 °C до использования.
  2. Приготовьте свежую 2-кратную среду для сосудистой дифференцировки, дополнив среду CM+/- bFGF (100 нг·мл-1) и VEGF-A (50 нг·мл-1). Хранить средство при температуре 4 °C до использования.
  3. Соберите висячие капли в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки P1000 и удалите надосадочную жидкость через несколько минут после осаждения EB.
  4. Ресуспендировать БЭ в 3 мл 2-кратной среды для сосудистой дифференцировки, перенести суспензию ЭБ в одну суспензию, покрытую агаром, равномерно распределить БЭ, чтобы избежать агрегации.
  5. Инкубируйте чашки в инкубаторе CO 2 и обновляйте среду каждые2 дня до 9-го дня, используя 1x среду для сосудистой дифференцировки в присутствии bFGF (50 нг·мл-1) и VEGF-A (25 нг·мл-1).
  6. В качестве альтернативы добавляют тромбоцитарный фактор роста-BB (PDGF-BB) (10 нг · мл -1 на 4-й день и 5 нг · мл-1 на 6-й и 8-й день) в сосудистую дифференцировочную среду, чтобы стимулировать дифференцировку клеток стенки.

5. Анализ проточной цитометрии

  1. Соберите 9-дневные ЭБ в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки P1000 и промойте их один раз теплым PBS.
  2. Добавьте 1 мл среды G-MEM BHK-21, содержащей 0,2 мг·мл-1 коллагеназы А, и инкубируйте клетки в инкубаторе CO2 в течение 5 минут.
  3. Диссоциируйте ЭБ, аккуратно пипетируя вверх и вниз пипеткой P1000.
  4. Остановите активность коллагеназы, добавив 1 мл холодной среды G-MEM BHK-21 с 10% FBS.
  5. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 мин при RT.
  6. Ресуспендируют клетки в 500 мкл PBS с 2% FBS.
  7. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра Нойбауэра.
  8. Ресуспендировать 400 000 клеток в 100 мкл PBS с 2% FBS на одно условие окрашивания.
  9. Инкубируют клетки в течение 45 мин при 4 °C со следующими антителами: конъюгированным антителом PECAM-1 против мыши APC (клон MEC13.3) и конъюгированным антителом против мыши CD45 (клон 30-F11) или антителами контроля изотипа.
  10. Дважды промойте клетки 1 мл PBS, содержащего 2% FBS.
  11. Ресуспендируют клетки, чтобы достичь конечной концентрации 5 x10,6 клеток на мл.
  12. Отфильтруйте ячейки с помощью пробирки из полистирола с круглым дном и защелкивающейся крышкой сетчатого фильтра.
  13. Проанализируйте 20 000 событий PECAM-1 (+) с помощью проточной цитометрии.

6.3D Анализ прорастающего ангиогенеза и иммунофлюоресцентное окрашивание

  1. На 9-й день приготовьте среду для прорастания, добавив 10% FBS (об./об.), bFGF (50 нг·мл-1), VEGF-A (25 нг·мл-1), человеческий рекомбинантный эритропоэтин (hEPO) (20 нг·мл-1), человеческий интерлейкин-6 (IL-6) (10 нг·мл-1), 0,05 мМ β-меркаптоэтанол, NEAA (1x), L-глютамин (1x), пируват натрия (1x), коллаген крысиного хвоста I типа (1,25 мг·мл-1), и NaOH (3,1 мМ) в среду GMEM BHK-1.
  2. Чтобы избежать гелеобразования коллагена, поддерживайте среду для проращивания на льду до использования.
  3. Чтобы оценить эффект проангиогенных молекул, добавьте выбранное лекарство или носитель в среду для прорастания в выбранной концентрации.
  4. Соберите 9-дневные ЭБ из одной чашки агара диаметром 60 мм в коническую пробирку объемом 15 мл (эквивалентно одному условию) и удалите надосадочную жидкость через несколько минут после осаждения.
  5. Накройте дно чашки для культур диаметром 35 мм 1 мл прорастающей среды и инкубируйте при 37 ° C в течение 5 минут, чтобы вызвать гелеобразование.
  6. Ресуспендируют ЭБ в 2 мл среды для холодного проращивания.
  7. Перенесите суспензию в культуральную чашку диаметром 35 мм, покрытую первым слоем проращивающей среды.
  8. Распределите ЭБ по всей тарелке и убедитесь, что они находятся на равном расстоянии друг от друга. Инкубируйте чашку в инкубаторе CO2 . Формирование первого ростка происходит в течение 24-48 часов.
  9. На 12-й день коллагеновый гель, содержащий ЭБ, осторожно переносится на предметное стекло (75 х 26 мм) с помощью шпателя.
  10. Удалите лишнюю жидкость с помощью пипетки (P1000) и обезвоживайте гель, положив поверх геля марлевый лист нейлонового льна и впитывающие фильтрующие карты (гелевую промокательную бумагу). Надавите, поместив груз (250 г) на 2 мин. Осторожно снимите нейлоновую / фильтровальную бумагу и дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе в течение 30 минут при RT.
  11. Промойте предметные стекла три раза с помощью PBS в течение 5 минут при RT.
  12. Исправьте ЭБ раствором цинка (см. Таблицу материалов) о/при 4 °C. В качестве альтернативы можно закрепить мозаичные флуоресцентные ЭБ параформальдегидом (ПФА) (4%) o/n при 4 °C в темноте.
  13. Снимите фиксатор. Промойте предметные стекла пять раз с помощью PBS в течение 5 минут при RT.
  14. Пермеабилизируйте ЭБ в PBS, содержащий 0,1% Triton-X100, в течение 15 мин при ЛТ.
  15. Удалите раствор для пермеабилизации. Промойте предметные стекла пять раз с помощью PBS в течение 5 минут.
  16. Инкубируйте ЭБ в блокирующем буфере (PBS с 2% бычьим сывороточным альбумином, BSA) в течение 1 ч при ЛТ.
  17. Чтобы окрасить эндотелиальные ростки, используйте первичное антитело против мыши против PECAM-1 крысы (разведение 1:100) в блокирующем буфере o/n при 4 ° C.
  18. Промойте предметные стекла пять раз с помощью PBS в течение 5 минут.
  19. Инкубируйте предметные стекла с вторичным антителом Alexa 555 против крыс в блокирующем буфере (разведение 1:250) и, при необходимости, с FITC-конъюгированным антителом против α-SMA в блокирующем буфере (разведение 1:250) для окрашивания клеток росписи в течение 2 ч при RT в темноте.
  20. Промойте предметные стекла три раза с помощью PBS в течение 5 минут и один раз с H20 перед их установкой.

7. Конфокальная визуализация, морфометрический и количественный анализ эндотелиальных ростков БЭ

  1. Получение изображений иммуноокрашенных ЭБ с высоким разрешением путем слияния в фокальной плоскости (z-стекирование) с помощью конфокального микроскопа. Используйте объектив с 10-кратным увеличением для получения изображения целых ЭБ.
  2. Проанализируйте изображения, полученные с помощью ImageJ, для оценки морфологии и количественной оценки характеристик положительных эндотелиальных ростков PECAM-1 в соответствии с установленными методами количественной оценки13,14,21.
    1. Рассчитайте среднее количество эндотелиальных ростков на ЭБ, вручную подсчитав общее количество ростков на отдельные ЭБ.
    2. Измерьте длину отдельных ростков с помощью инструмента рисования ImageJ. Определите основание эндотелиального ростка, начиная с области ядра БЭ, и вручную проведите линию до конца кончика ростка.
    3. Рассчитайте среднее количество ячеек верхушки на росток, вручную подсчитав количество клеток кончиков на отдельный росток, а затем рассчитайте среднее значение на ЭБ.
    4. Рассчитайте ориентацию филоподии, вручную определив ось родительского ростка, и измерьте острый угол между ними с помощью программного инструмента угла ImageJ. Рассчитайте количество ростков с ориентацией >50° и разделите его на общее количество ростков интересующего ЭБ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Углы всегда находились в диапазоне от 0° до 90°.
  3. Получение изображений иммуноокрашенных БЭ с высоким разрешением с помощью конфокального микроскопа. Используйте объектив с 40-кратным увеличением для получения изображений с высоким разрешением отдельных эндотелиальных ростков.
  4. Количественно оцените покрытие сосудов положительными ЕС-ростками PECAM-1, окруженными положительными MC α-SMA, с помощью программного обеспечения ImageJ.
    1. Разделите объединенные изображения на отдельные красный и зеленый каналы.
    2. Преобразуйте изображения в двоичную форму.
    3. Измерьте общую клеточную площадь ростка, занятую отдельно PECAM-1 (эндотелиальные клетки, помеченные красным цветом) и α-SMA (настенные клетки, помеченные зеленым цветом) положительными клетками.
    4. Сгенерируйте объединенное изображение с помощью функции калькулятора изображений и оператора AND. Измерьте общую площадь ячейки изображения. Чтобы рассчитать охват, разделите площадь колокализованного изображения на площадь двоичного изображения PECAM-1.
  5. Чтобы проанализировать клеточную конкуренцию за положение эндотелиальных клеток верхушки / стебля ростков, разработанных мозаичными ЭБ, вручную оцените количество верхушечных клеток и отметьте их генотипическое происхождение на основе сигнала флуоресценции. Рассчитайте средние значения на EB.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Обзор протокола анализа прорастания кровеносных сосудов показан на рисунке 1. Девятидневные БЭ, полученные из трех независимых линий 129 / Ola mESC (Z / Red, R1 и E14), были ферментативно диссоциированы на отдельные клетки с использованием коллагеназы A. Клетки окрашивали для PECAM-1 и ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Этот протокол описывает объективный, надежный и воспроизводимый 3D-анализ прорастания сосудов на основе EB, который поддается скринингу лекарств и генов, модулирующих ангиогенез. Этот метод имеет преимущества по сравнению со многими широко используемыми двумерными (2D) анализами с испол...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), ведущей программы стипендиатов Марии Склодовской-Кюри COFUND и Ассоциации Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolMilipore, Merck805740Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
Agar NobleDifco, BD Pharmigen214220
Alexa Fluo 555 goat anti rat IgGLife technologiesA21434
APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3)BD Biosciences551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone  R35-95)BD Biosciences553932
Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscopeZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)Peprotech450-33
Benchtop Centrifuge, Allegra X-15RBeckman Coulter392932
Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line)Telstar133H401001
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA9418
Cell counting chamber, Buerker, 0.100mmMarienfeld640211
Cell culture dishes 60 x 15mmCorning353802
Cell culture dishes, 35 x 10 mmCorning353801
Cell culture plates 12-wellCorning3512
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBiorad1855196
Chicken serumSigma-AldrichC5405
CHIR-99021 (CT99021) HClSelleckchemS2924
Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mgCorning354249
Collagenase ARoche10103586001
Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5Leica
Cover glasses, 24 × 50 mmVwr631-0146
DAPT γ?secretase inhibitorSigma AldrichD5942
DC101 anti mouse VEGFR-2 CloneBioXcellBP0060
DC101 isotype rat IgG1BioXcellBP0290
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438-5XBiohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
DPBS (10x), no calcium, no magnesiumGibco, Thermofisher scientific14200067
EDTA 40 mMGibco, Thermofisher scientific15575-038
Embryonic stem-cell Fetal Bovine SerumGibco, Thermofisher scientific16141-079Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year
Eppendorf Microcentrifuge 5415REppendorf AG Z605212
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL)Roche11120166001
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10? units  1 mL)Milipore, MerckESG1107
Falcon tubes 15 mLGreiner Bio-One188271
Falcon tubes 50 mLGreiner Bio-0ne227270
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200Greiner Bio-One739288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10Greiner Bio-One771288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000Greiner Bio-One740288
FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4)Sigma AldrichF3777
FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)Biolegend103107
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530)Biolegend400605
Fluorscent mounting mediaDAKOS3023
GascompressCutisoft45846
Gauze Cutisoft 10 x 10 cmBsn Medical45844_00
Gel blotting paper, Grade GB003WhatmanWHA10547922
Gelatin solution, type BSigma-AldrichG1393-100 ml
Glasgow's MEM (GMEM)Gibco, Thermofisher scientific21710082
IHC Zinc FixativeBD Pharmigen550523
IncuSafe CO2 IncubatorPHCBiMCO-170AICUV-PE
Interleukin-6, human (hIL-6)Roche11138600001
L-Glutamine 200 mMGibco, Thermofisher scientific25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Gibco, Thermofisher scientific11140035
Microscope slide boxKartell Labware278
Microscope slide, StarfrostKnittel glassVS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00099064
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00114576
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts  (2 M)Gibco, Thermofisher scientificA24903Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely
Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)ATCCSCRC-1033Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)].
Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)].
Mouse embryonic stem cells line E14Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001).
Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011)ATCCSCRC-1011Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)].
Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola)Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)].
NanoDrop 1000 UV/VIS SpectrophotometerThermo Fischer ScientificND-1000
PD0325901SelleckchemS1036
PDGF-BB, Recombinant HumanPeprotech100-14B
Pecam-1 antibody, Rat Anti-MouseBD Biosciences550274
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)Gibco, Thermofisher scientific15140122
Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterileGreiner Bio-One633181
Pipetboy acu 2Integra-Biosciences155 019
Pipetman G Multichannel P8 x 200GGilsonF144072
Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000GGilsonF167360
Recombinant Human BMP-4 ProteinR&D Systems314-BP
RNeasy Plus mini KitQIAGEN74134
Serological pipettes, 10 mLGreiner Bio-One607 180
Serological pipettes, 25 mLGreiner Bio-One760 180
Serological pipettes, 5 mLGreiner Bio-One606 180
Sodium hydroxide (NaOH)Merck106498
Sodium pyruvate 100 mMGibco, Thermofisher scientific11360039
Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer capCorning352235
Thermal cycler, T100Biorad1861096
Triton X-100 (BioXtra)Sigma AldrichT9284
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco, Thermofisher scientific15250061
Trypsin (2.5%)Gibco, Thermofisher scientific15090046
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mLCorning430758
VEGFA165 , recombinant murinePeprotech450-32
Water, SterileFresenius-KabiB230531
Waterbath, Lab-Line DigitalThermo Fischer Scientific18052A

References

  1. Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
  2. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  3. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).
  4. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  5. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
  6. Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
  7. Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
  8. Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
  9. Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215(2016).
  10. Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
  11. Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
  12. Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).
  13. Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
  14. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
  15. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  16. Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
  17. Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
  18. Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
  19. Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
  20. van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678(2019).
  21. Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
  22. Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
  23. Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
  24. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  25. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
  26. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
  27. Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
  28. Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
  29. Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
  30. Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
  31. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  32. Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, Clifton, N.J. 325-344 (2017).
  33. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
  34. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  35. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).
  36. Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
  37. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671(2018).
  38. Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147(2020).
  39. Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002(2019).
  40. Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bioengineering. 7 (1), Basel, Switzerland. 17(2020).
  41. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE171