Ядерная миграция в ооците дрозофилы

Резюме

При дрозофилеядро ооцита подвергается микротрубочезависимой миграции во время оогенеза. Здесь мы описываем протокол, который был разработан для отслеживания миграции путем выполнения живой визуализации на камерах яиц ex-vivo. Наша процедура поддерживает яйцеклетки живыми в течение 12 часов для получения многопозиционных 3D-покадровых фильмов с использованием конфокальной микроскопии с вращающимся диском.

Аннотация

Визуализация живых клеток особенно необходима для понимания клеточных и молекулярных механизмов, которые регулируют движения органелл, перестройки цитоскелетов или паттерны полярности внутри клеток. При изучении позиционирования ядра ооцита методы визуализации в реальном времени необходимы для захвата динамических событий этого процесса. Яичная камера дрозофилы представляет собой многоклеточную структуру и отличную модельную систему для изучения этого явления из-за ее большого размера и наличия многочисленных генетических инструментов. Во время среднего оогенеза дрозофилы ядро мигрирует из центрального положения в ооците, чтобы принять асимметричное положение, опосредованное силами, генерируемыми микротрубочами. Такая миграция и позиционирование ядра необходимы для определения осей полярности эмбриона и последующей взрослой мухи. Одной из характеристик этой миграции является то, что она происходит в трех измерениях (3D), создавая необходимость для живой визуализации. Таким образом, для изучения механизмов, регулирующих ядерную миграцию, мы разработали протокол культивирования расчлененных яйцеклеток и выполнения живой визуализации в течение 12 ч путем покадровых приобретений с использованием конфокальной микроскопии со спиннинговым диском. В целом, наши условия позволяют нам сохранять яйцеклетки дрозофилы живыми в течение длительного периода времени, тем самым позволяя визуализировать завершение ядерной миграции в большом количестве образцов в 3D.

Введение

В течение нескольких лет ооцит дрозофилы появился в качестве модельной системы для изучения ядерной миграции. Ооцит дрозофилы развивается в многоклеточной структуре, называемой камерой яйцеклетки. Яйцеклетки охватывают 16 половых клеток (15 клеток-кормилиц и яйцеклетку), окруженных эпителиальным слоем фолликулярных соматических клеток. Развитие яичной камеры было подразделено на 14 стадий(рисунок 1А),в ходе которых яйцеклетка будет расти и накапливать запасы, необходимые для раннего развития эмбриона. При развитии, при реорганизации микротрубочек и асимметричном переносе материнских детерминант, ооцит поляризуется по ант....

протокол

1. Подготовка среды визуализации

1. Приготовьте свежие средства в день использования. Пипетка 200 мкл среды Schneider (содержащая L-глютамин и 0,40 г/л NaHCO_3, дополненная 10% термоинактивированной сывороткой для телят плода, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина).
2. Добавка с 30 мкл инсулина 10 мг/мл.
3. Добавьте 4 мкл инактивированной теплом сыворотки для икр плода.

2. Подготовка камер наблюдения

1. Наконечником пипетки нанесите небольшое количество силиконовой смазки по всему отверстию на нижней стороне проколотого слайда(рисунок 4D).
2. Располож....

Результаты

До миграции ядро является динамичным и колеблется вокруг центрального положения в течение периода, определяемого как предмиграции. Эти небольшие движения отражают баланс толкающих и тянущих сил, которые поддерживают равновесие в середине ооцита. Количественно измещая траектории яде.......

Обсуждение

Другие протоколы описывают, как подготовить и культивировать камеры яиц дрозофилы ex vivo для анализа живой визуализации^12,13. Новизна этого протокола заключается в использовании камеры визуализации, построенной с использованием полого алюминиевого с?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetize CO2 pad	Dutscher	789060	Anesthetize flies
Coverslip (24x50 mm)	Knittel Glass	VD12450Y100A	Observation-chamber preparation
Forceps Dumont #5	Carl Roth	K342.1	Dissection
Stainless steel needles	Entosphinx	20	Dissection
Heat-inactivated fetal calf serum	SIGMA-ALDRICH	F7524	Imaging medium
Insulin solution bovine pancreas	SIGMA-ALDRICH	10516 - 5ml	Imaging medium
Penicilin/Streptomycin solution	SIGMA-ALDRICH	P0781	Imaging medium
Permeable membrane	Leica	11521746	Observation-chamber preparation
Schneider Medium	Pan Biotech	P04-91500	Imaging medium
Silicon grease	BECKMAN COULTER	335148	Observation-chamber preparation
Spinning disk confocal	Zeiss	CSU-X1	Nuclear migration observation
Voltalef oil 10S	VWR	24627 - 188	Observation-chamber preparation