Выделение активного caenorhabditis elegans Nuclear Extract и восстановление для транскрипции in vitro

Резюме

Здесь мы опишем подробный протокол выделения активного ядерного экстракта из личиночной стадии 4 C. elegans и визуализации транскрипционной активности в системе in vitro .

Аннотация

Caenorhabditis elegans является важной модельной системой для биологических исследований с тех пор, как она была введена в 1963 году. Однако C. elegans не был полностью использован в биохимическом исследовании биологических реакций с использованием его ядерных экстрактов, таких как транскрипция in vitro и репликация ДНК. Значительным препятствием для использования C. elegans в биохимических исследованиях является разрушение толстой внешней кутикулы нематоды без ущерба для активности ядерного экстракта. Хотя для разрушения кутикулы используется несколько методов, таких как гомогенизация Dounce или обработка ультразвуком, они часто приводят к нестабильности белка. Не существует установленных протоколов выделения активных ядерных белков из личинок или взрослых C. elegans для реакций in vitro . Здесь протокол подробно описывает гомогенизацию личинок стадии 4 C. elegans с использованием гомогенизатора Balch. Гомогенизатор Balch использует давление, чтобы медленно проталкивать животных через узкую щель, разрывающую кутикулу в процессе. Однородная конструкция и точная обработка гомогенизатора Balch обеспечивают последовательное измельчение животных между экспериментами. Фракционирование гомогената, полученного из гомогенизатора Балха, дает функционально активный ядерный экстракт, который может быть использован в методе in vitro для анализа транскрипционной активности C. elegans.

Введение

Маленькая, свободно живущая нематода Caenorhabditis elegans является простым, но мощным модельным организмом для решения широкого круга биологических вопросов. С момента своего появления в 1963 году нематоды были бесценны для ответа на вопросы в нейробиологии, метаболизме, старении, развитии, иммунитете и ^{генетике1}. Некоторые из многих характеристик животного, которые делают его идеальным модельным организмом, включают короткое время генерации, эффективность РНК-интерференции, прозрачное тело и завершенные карты как его клеточной линии, так и нервной системы.

Хотя вклад нематод в науку огромен, они были недо....

протокол

1. Подготовка СМИ

1. Приготовьте стерильный лизогенный бульон (LB) агаровые пластины и жидкие среды, следуя инструкциям производителя.
2. Полоса кишечной палочки (E. coli) штамм OP50 на агаровой пластине LB. Инкубируйте полосу бактерий при 37 °C в течение ночи.
3. Храните пластину E. coli OP50 при температуре 4 °C после инкубации. Пластину E. coli OP50 можно безопасно хранить при 4 °C в течение 2 недель, если завернуть в парапленку для предотвращения потери влаги.
4. Приготовьте 2 л среды для роста нематод (NGM), используя рецепт, приведенный в таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нистатин является ....

Результаты

Следуя описанным шагам, следует получить функциональный ядерный экстракт (рисунок 1), отклонение на этапах измельчения или промывки может привести к плохой активности или низкому выходу. Если получен функциональный ядерный экстракт C. elegans , он буд.......

Обсуждение

C. elegans является привлекательным модельным организмом для изучения системы эукариотической транскрипции из-за ее недорогого обслуживания и простоты генетических манипуляций. Здесь описан протокол последовательного выделения функционально активного ядерного экстракта из L4 C. e.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010