Построение модельных липидных мембран, включающих рецепторы, связанные с G-белком (GPCR)

Резюме

Этот протокол использует набухание агарозы в качестве мощного и обобщаемого метода включения интегральных мембранных белков (ИМП) в гигантские одноламеллярные липидные везикулы (ГУВ), как описано здесь для восстановления человеческого белка рецептора серотонина 1А (_5-HT1AR), одного из классов фармакологически важных рецепторов, связанных с G-белком.

Аннотация

Надежные исследования in vitro структуры и функции интегральных мембранных белков были проблемой из-за сложности плазматической мембраны и многочисленных факторов, которые влияют на поведение белка в живых клетках. Гигантские одноламеллярные везикулы (ГУВ) представляют собой биомиметическую и высоко перестраиваемую модельную систему in vitro для исследования белково-мембранных взаимодействий и зондирования поведения белка точным, зависимым от стимула способом. В этом протоколе мы представляем недорогой и эффективный метод изготовления ГУВ с рецептором серотонина 1А человека (_5-HT1AR), стабильно интегрированным в мембрану. Мы производим ГУВ с использованием модифицированного метода набухания гидрогеля; путем осаждения липидной пленки поверх смеси агарозы и _5-HT1AR, а затем гидратации всей системы, везикулы могут быть сформированы с правильно ориентированным и функциональным _5-HT1AR, включенным в мембрану. Эти ГУВ затем могут быть использованы для изучения белково-мембранных взаимодействий и поведения локализации с помощью микроскопии. В конечном счете, этот протокол может продвинуть наше понимание функциональности интегральных мембранных белков, обеспечивая глубокое физиологическое понимание.

Введение

Синтетические модельные мембраны являются мощным инструментом в исследовании фундаментальных свойств и функций биомембран. Гигантские одногламеллярные везикулы (ГУВ) являются одной из наиболее заметных платформ для изучения различных свойств плазматической мембраны и могут быть спроектированы для имитации различных физиологических условий1,2,3,4,5,6,7,8. Хорошо известно, что плазматическая мембрана и ее ....

протокол

1. Маркировка белка

1. Позволяет NHS-родамину, фрагментам мембраны _5-HT1A и одной спиновой обессоливающей колонне MWCO 7 К уравновешиваться при комнатной температуре.
2. Растворить 1 мг NHS-родамина в 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
3. Добавьте 5 мкл 1 М раствора бикарбоната натрия для повышения рН раствора _5-HT1AR до рН 8.
4. Добавьте 3,66 мкл раствора NHS-родамина к 50 мкл _{раствора 5-HT1AR} и пипетку осторожно вверх и вниз в микроцентрифужной пробирке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что у вас по крайней мере 10-кратный молярный избыток NHS-родамина.
5. Держите смесь защищенной от света и поставьте на р....

Результаты

Измеряли концентрацию белка, а степень маркировки рассчитывали как молярное соотношение между красителем и белком 1:1. Изучив ГУВ с помощью конфокальной микроскопии, мы смогли подтвердить успешное образование и белковую интеграцию везикул. Липиды были помечены 0,4 моль% ATTO 488-DPPE, а белок ?.......

Обсуждение

Мы определили два шага, которые имеют решающее значение для успеха общего протокола: плазменная обработка и осаждение липидов. Плазменная очистка покровов имеет важное значение для обеспечения адекватного покрытия и адгезии гидрогеля агарозы к стеклянному покрову. Плазменная очистк?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850375C-25mg
TI-Eclipse inverted microscope	Nikon, Melville, NY	Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings	Sterling Seal & Supply, Neptune, IN	5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera	Photometrics, Huntington Beach, CA	Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm	Coherent, Santa Clara, CA	488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments	Perkin Elmer, Waltham, MA	RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)	ATTO-TEC, Siegen, Germany	AD 488-155
Bench top plasma cleaner	Harrick Plasma, Ithaca, NY	PDC-32G
bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A9418
chloroform (CHCl3)	Millipore Sigma, Burlington, MA	CX1055
Cholesterol (Chol)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom	Corning, Corning, NY	3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic	Elma, Singen, Germany	[no longer sold on main website]
glucose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	G7528
methanol (MeOH)	Millipore Sigma, Burlington, MA	MX0485
NanoDrop ND-1000	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	ND-1000
NHS-Rhodamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)	Corning, Corning, NY	21-040
spinning-disc CSUX confocal head	Yokogawa,Tokyo, Japan	CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips	ChemGlass, Vineland, NJ	CLS-1760
sucrose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	S7903
Sykes-Moore chambers	Bellco, Vineland, NJ	1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A5030
VWR Analog Heatblock	VWR International, Radnor, PA	[no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator	VWR International, Radnor, PA	10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	89882