Модель кровотечения при трансекции хвостовой вены у полностью обезболенных мышей с гемофилией А

Резюме

Модель кровотечения рафинированной трансекции хвостовой вены (TVT) у анестезируемых мышей является чувствительным методом in vivo для оценки гемофильного кровотечения. Эта оптимизированная модель кровотечения TVT использует кровопотерю и время кровотечения в качестве конечных точек, совершенствуя другие модели и избегая смерти в качестве конечной точки.

Аннотация

Модели хвостовых кровотечений являются важными инструментами в исследованиях гемофилии, особенно для оценки эффектов прокоагулянтов. Модель выживания при трансекции хвостовой вены (TVT) была предпочтительной во многих условиях из-за чувствительности к клинически значимым дозам FVIII, тогда как другие установленные модели, такие как модель хвостового зажима, требуют более высоких уровней прокоагулянтных соединений. Чтобы избежать использования выживаемости в качестве конечной точки, мы разработали модель TVT, устанавливающую кровопотерю и время кровотечения в качестве конечных точек и полную анестезию в течение всего эксперимента. Вкратце, обезболенных мышей позиционируют с хвостом, погруженным в умеренный физиологический раствор (37 ° C) и дозированным с испытуемым соединением в правой боковой хвостовой вене. Через 5 мин левую боковую хвостовую вену перекрывают с помощью шаблонной направляющей, хвост возвращают в физиологический раствор, а все эпизоды кровотечения контролируют и регистрируют в течение 40 мин при сборе крови. Если кровотечение не происходит через 10 минут, 20 минут или 30 минут после травмы, сгусток осторожно бросают вызов, дважды протирая разрез влажным марлевым тампоном. Через 40 мин кровопотеря измеряется количеством гемоглобина, поступающего в физиологический раствор. Эта быстрая и относительно простая процедура приводит к последовательным и воспроизводимым кровотечениям. По сравнению с моделью выживания TVT, она использует более гуманную процедуру без ущерба для чувствительности к фармакологическому вмешательству. Кроме того, можно использовать оба пола, уменьшая общее количество животных, которых необходимо разводить, в соответствии с принципами 3R. Потенциальным ограничением в моделях кровотечений является стохастический характер гемостаза, который может снизить воспроизводимость модели. Чтобы противостоять этому, ручное разрушение сгустка гарантирует, что сгусток будет оспорен во время мониторинга, предотвращая первичный (тромбоцитарный) гемостаз от остановки кровотечения. Это дополнение к каталогу моделей кровоточащих травм предоставляет возможность охарактеризовать эффекты прокоагулянтов стандартизированным и гуманным образом.

Введение

Животные модели необходимы для понимания патогенеза гемофилии и разработки и тестирования схем лечения и терапии. Нокаутирующая мышь фактора VIII (F8-KO) является широко используемой моделью для изучения гемофилии А ^1,2. Эти мыши повторяют ключевые особенности заболевания и широко используются для разработки методов лечения, таких как рекомбинантные продукты FVIII ^3,4,5 и стратегии генной терапии ^6,7.

Существуют различные модели пов....

протокол

Все процедуры, описанные в этом протоколе, были одобрены Органом по защите животных в Novo Nordisk A/S и Датской инспекцией по экспериментам на животных, Министерством продовольствия, сельского хозяйства и рыболовства Дании. Оптимизированный 40-минутный метод включает анестезию и время дозирования в конструкции (рисунок 1). Для этой процедуры требуются гемофильные мыши обоих полов в возрасте 10-16 недель.

1. Подготовка к исследованию

1. Приготовьте дозирующие растворы в правильных концентрациях.
2. Запустите водяную баню и нагрейте до 37 °C. Заполните 15 мл центрифужных пробирок для забора крови ....

Результаты

Для оценки применимости оптимизированной модели было проведено исследование на мышах F8-KO (генетический фон C57BL), которым вводили коммерчески доступную заместительную терапию рекомбинантным фактором VIII (rFVIII); были протестированы четыре различные дозы: 1 МЕ/кг, 5 МЕ/кг, 10 МЕ/кг и 20 МЕ/кг. Кро.......

Обсуждение

Этот оптимизированный метод трансекции хвостовой вены (TVT) имеет ряд преимуществ по сравнению с методом выживания TVT. Животные полностью обезболиваются в течение всего периода исследования, что облегчает работу с мышами и повышает самочувствие животных. Кроме того, в отличие от модели ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 Scalpel blade	Swann-Morton	503
15 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One, Austria	188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing	BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe	320830
Advate	Takeda, Japan		Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuge	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gauze
Haematological analyser	Sysmex	CT-2000iv
Heating lamp on stand	Phillips	IR250
Heating pad with thermostat	CMA	model 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent	HemoCue, Denmark	HemoCue calibrator, 707037	Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Magnifier with lights	Eschenbach
Measuring template (Aluminum)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips	Finnpipette
Photometer	Molecular Devices Corporation, CA, USA	SpectraMax 340 photometer
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl	Fresenius Kabi, Sweden	883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction	Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat	TYP 3/8 Julabo