Мышиная модель прямого анастомоза преспинальным путем для операции по пересадке нерва

Резюме

Мы смоделировали клиническую хирургию для создания протокола прямого анастомоза двусторонних нервов плечевого сплетения преспинальным путем у мышей, что способствовало изучению нейронных механизмов, лежащих в основе реабилитации при пересечении нервного переноса после травм центральной и периферической нервной системы.

Аннотация

Операция по пересадке нерва через плечо является мощным подходом к восстановлению поврежденных верхних конечностей у пациентов с повреждениями отрыва плечевого сплетения. В последнее время эта операция была творчески применена в клиническом лечении черепно-мозговой травмы и достигла существенной реабилитации парализованной руки. Это функциональное восстановление после операции предполагает, что периферическое сенсомоторное вмешательство индуцирует глубокую нейропластичность, чтобы компенсировать потерю функции после повреждения головного мозга; Однако лежащий в его основе нейронный механизм плохо изучен. Таким образом, необходима эмерджентная клиническая модель на животных. Здесь мы смоделировали клиническую хирургию для создания протокола прямого анастомоза двусторонних нервов плечевого сплетения преспинальным путем у мышей. Нейроанатомические, электрофизиологические и поведенческие эксперименты помогли определить, что перенесенные нервы этих мышей успешно реиннервировали поврежденную переднюю конечность и способствовали ускорению восстановления движений после черепно-мозговой травмы. Таким образом, на мышиной модели были выявлены нейронные механизмы, лежащие в основе реабилитации при перекрестном переносе нерва после травм центральной и периферической нервной системы.

Введение

Плечевое сплетение (АД) состоит из пяти нервов с различными спинномозговыми сегментами (С5-Т1), отвечающими за чувствительность и движение в руке, кисти и пальцах. После выхода этих пяти нервов АД из спинного мозга они сливаются, образуя три нервных ствола: верхний (образованный слиянием С5 и С6), медиальный (от С7) и нижний (ветви С8 и Т1). Тяжелые травмы, особенно вследствие дорожно-транспортных происшествий, часто приводят к отрыву нервных корешков АД, и такая дисфункция оказывает разрушительное воздействие на^{больных1}. В качестве мощного клинического подхода была проведена операция по пересадке пересечения нерва для восстановления повреждений АД в результате отрыва путем воссоединения поврежденных нервных окончаний со здоровой стороной АД ^2,3. Эта операция приводит к функциональному улучшению поврежденных рук и прямой реорганизации сенсомоторной коры в обоих полушариях у пациентов⁴. Исследования на животных показали, что резкая реорганизация в корковых цепях индуцировалась после пересечения нервного пересадки. Поскольку периферическая сенсомоторная модификация может реактивировать дремлющую пластичность зрелого мозга, операция по пересадке нервов также демонстрирует большой потенциал в восстановлении повреждений головного мозга⁶.

Недавно мы подтвердили возможность творческого использования перекрестного переноса нервов в качестве новой стратегии изменения периферических нервов при проблемах с центральной нервной системой. Для достижения значительного функционального восстановления парализованной руки путем переноса нерва С7 с непарализованной стороны на парализованную сторону у пациента после черепно-мозговой травмы^{применялся} контралатеральный шейный пересадка седьмого нерва (CC7). Уникальной особенностью этой хирургической операции является то, что сенсорные и двигательные сигналы парализованной верхней конечности сообщаются в контралесционное полушарие через смещенный нерв «левый-правый кроссовер». Примечательно, что функциональное восстановление, вызванное операцией CC7, не ограничивается функцией, иннервируемой самим нервом C7⁸. Кроме того, операция CC7 может быть использована не только для лечения детей с церебральным параличом, но и для достижения реабилитации у пациентов среднего и пожилого возраста, перенесших инсульт. Таким образом, есть достаточно оснований полагать, что перекрестный перенос нервов может стимулировать нейропластичность для ускорения восстановления моторики после повреждения мозга путем модуляции периферической сенсомоторной системы.

Несмотря на то, что операция по пересадке нервов достигла значительной реабилитации в клиническом лечении как травм плечевого сплетения (BPI), так и травм головного мозга, нейронные механизмы, лежащие в основе этой операции, остаются плохо изученными. Отсутствие подходящей животной модели с клиническими признаками ограничило изучение внутренних механизмов. Традиционно в клинике нервный корешок С7, контралатеральный к очагу поражения, переносится на поврежденную сторону через нервный трансплантат (например, локтевой нерв, изольный нерв или подкожный нерв) и соединяется с пораженным плечевым сплетением (например, срединным нервом, корешком С7 или нижним стволом)^2,3,9. Относительно новая модификация этой операции заключается в том, что непораженный корешок С7 переносится непосредственно в пораженный нерв С7 преспинальным путем без какого-либо зазора, что предполагает оптимальное решение⁷. В настоящее время мыши демонстрируют преимущество в специфичности типов клеток и разнообразии генетических штаммов и более пригодны для изучения нейрофизиологических механизмов. Таким образом, клиническая хирургия была смоделирована для создания протокола прямого анастомоза двусторонних нервных корешков С7 преспинальным путем у мышей и способствовать изучению нейронных механизмов, лежащих в основе реабилитации при пересечении нервного переноса.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу за экспериментальными животными Фуданьского университета и Китайской академией наук в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения. Использовали восьминедельных взрослых самцов мышей C57BL/6N.

1. Предоперационная подготовка

1. Обеспечьте надлежащий запас стерилизованных хирургических инструментов, оборудования, обезболивающих и обезболивающих препаратов.
2. Обеспечьте достаточное рабочее пространство на операционном столе.
3. Подготовьте операционный стол, используя индивидуальную хирургическую пенопластовую доску, покрытую подгузниками, в качестве кровати для мыши. Закрепите грелку к пенопласту медицинской лентой, обтянутой стерильной марлей.
4. Создайте ретракторы, согнув акупунктурную иглу с помощью сосудистых щипцов, сложив ее пополам, а затем согнув кончик сложенной акупунктурной иглы в крючок. Закрепите резиновую полоску на конце акупунктурной иглы и с помощью большого пальца прикрепите конец резиновой полоски к пенопластовой доске.
5. Откалибруйте стереомикроскоп; Выбирайте стереомикроскоп с достаточным фокусным расстоянием. Накройте кнопки зума/фокусировки стерилизованной алюминиевой фольгой, чтобы хирург мог регулировать их во время операции. Стерилизованная алюминиевая фольга была помещена на кнопки зума/фокусировки, что позволило хирургу использовать ее в стерильных перчатках.

2. Мышиная анестезия и подготовка

1. Взвесьте мышь и обезболивайте в соответствии с массой тела (изофлуран 3%). Убедитесь, что мышь не реагирует на защемление межпальцевых промежутков лапы, чтобы подтвердить глубину анестезии. На протяжении всей процедуры должна поддерживаться достаточная глубина анестезии (1% изофлурана).
2. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза с обеих сторон, чтобы предотвратить раздражение или пересыхание роговицы во время операции.
3. Подготовьте место операции, сбрив шерсть на шее и груди автоматической машинкой для стрижки. Удалите и очистите выпавшие волосы.
4. Поместите мышь в положение лежа на спине на грелку, покрытую стерильной марлей. Поддерживайте температуру мыши на уровне 37 °C в течение всей работы. Зафиксируйте мышь медицинской лентой, чтобы передние конечности отвели горизонтально и не позволили задним конечностям и хвосту двигаться. На мышей надевали стерилизованную одноразовую хирургическую простыню с соответствующим отверстием.

3. Порядок проведения операции

1. Трамадол вводят в качестве упреждающего обезболивающего средства (20 мг/кг, в/м). Отметьте поперечный разрез на верхнем крае ключицы. Используйте три цикла чередования скрабов из дезинфицирующего раствора йодофора и этанола для дезинфекции места операции. Перед операцией подтвердите глубину анестезии щипком пальца ноги.
2. Работая под микроскопом, сделайте поперечный разрез 4 мм по отметке стерильным скальпелем. При необходимости увеличивайте разрез во время процедуры.
3. Тупо рассекают через подкожную фасцию и определяют нижнюю границу подчелюстной железы. Потяните подчелюстную железу вверх, чтобы обнажить надключичную ямку и грудину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой области могут быть кровеносные сосуды малого калибра. Для остановки кровотечения можно использовать электрокоагуляцию.
4. Сделайте частичный срединный стернотомический разрез (~4 мм), разрезав грудину от головы до хвоста по средней линии. Защищают плевру, сердце и кровеносные сосуды во время стернотомии.
5. Определите грудино-подъязычную мышцу. Осторожно потяните за грудину с помощью двух небольших специальных ретракторов, сделанных из акупунктурных игл, и определите грудино-подъязычную мышцу над трахеей и пищеводом. Втяните эту мышцу, чтобы обнажить сонную артерию, внутреннюю яремную вену, диафрагмальный нерв, блуждающий нерв, трахею и пищевод.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно втяните грудину, чтобы избежать открытого пневмоторакса. В отличие от человека, пищевод мыши находится не позади трахеи, а примыкает к трахее с левой стороны.
6. Определите левое плечевое сплетение. У латерального края левой внутренней яремной вены вытяните фасцию и жировую ткань наружу, чтобы обнажить плечевое сплетение. Ищите верхний ствол, состоящий из нервов С5 и С6, который имеет три ветви. Определите средний ствол, состоящий из нерва С7, и нижний ствол, состоящий из нервов С8 и Т1, вдоль верхнего туловища до хвоста мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На поверхности плечевого сплетения имеются продольные кровеносные сосуды. Используйте электрокоагуляцию для предотвращения кровотечения. При разделении левого плечевого сплетения защищайте хилезный канал, чтобы избежать хилезного свища.
7. Заберите левый нерв С7. Рассекают передний отдел и задний отдел среднего ствола (нерв С7) дистально до уровня от деления до спинного мозга под ключицей и блокируют нерв С7 0,1 мл 2% лидокаина путем местной инфузии в нервный ствол. Резецируют нерв С7 пружинными ножницами ванны в местах его слияния с латеральным и задним канатиком. Обрежьте нерв С7 так, чтобы длина каждого деления была одинаковой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Передний и задний отделы нерва С7, а также передний и задний отделы верхнего и нижнего стволов проходят большое расстояние до слияния, поэтому нерв С7 должен быть достаточно свободен перед резекцией. На самом деле, нерв С7 не всегда делится на два отдела; Иногда его делят на три отдела, а в редких случаях даже на четыре.
8. Удалите левую пластинку C6 ventralis. Тщательно защитите диафрагмальный нерв и напрягите переднюю лестничную мышцу на уровне сегмента С6, чтобы обнажить нервный корешок С7. Срежьте микрощипцами небольшие ветви нерва С7, иннервирующие параспинальную мышцу. Осторожно вытащите нерв С7 и осторожно иссеките вентральную пластинку С6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Между медиальной стороной левой сонной артерии и латеральной стороной пищевода имеется костный выступ. Этот костный выступ является вентральной пластинкой^6-го шейного позвонка. Продольная мышца латерального края вентральной пластинки С6 является передней лестничной мышцей, а диафрагмальный нерв проходит по поверхности передней лестничной мышцы.
9. Заберите правый нерв С7. Тяжелая передняя лестничная мышца с правой стороны, аналогичная левой, и пересекает правый нервный корешок С7 близко к межпозвонковому отверстию. Рассеките правый нерв С7 от уровня его деления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно перережьте правый нерв C7, чтобы предотвратить повреждение кровеносных сосудов под нервом.
10. Пересадка левого нерва С7.
    1. Удалите мышечные longus colli рядом с телами позвонков частично с обеих сторон. Тупо отделить и расширить пространство между трахеей-пищеводом и телом позвонка.
    2. Отправьте пополам нейлоновые швы 5-0 с правой стороны тела позвонка на левую сторону через преспинальный путь.
    3. Соедините левый нерв С7 инфузионной трубкой и направьте нерв в правую сторону преспинальным путем.
    4. Осторожно втяните трахею и пищевод и соедините передний и задний отделы левого нерва С7 с правым нервным корешком С7 без натяжения, используя нейлоновые швы 12-0. Зашить эпиневрий вокруг нервов 4-5 швами, чтобы нервы сильно скрепились.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно выбрать пластиковую инфузионную трубку соответствующей толщины. Слишком тонкая трубка может повредить нерв, а слишком толстая трубка может повредить трахею и пищевод. Кроме того, пространство между трахеей-пищеводом и телом позвонка имеет V-образную форму, и отрезание части мышечного длинного желоба может сократить путь передачи.

4. Закрытие раны

1. Промойте рану стерильным физиологическим раствором и высушите стерильной марлей.
2. Зашить грудину и закрыть кожу монофиламентными нитями 5-0.

5. Послеоперационный уход

1. Подождите, пока мышь очнется от наркоза. Перенесите мышку в чистую клетку без подстилочного материала, но утепленную теплым одеялом. Наблюдайте за мышью, пока она не станет подвижной. Используйте трамадол (20 мг/кг, в/м) в качестве послеоперационного обезболивания.
2. Поместите мышей в клетку для восстановления и наблюдайте за ней до выздоровления. Восстановить воду и рацион мышей после операции. Ежедневно наблюдайте за мышами в послеоперационном периоде на предмет признаков нарушения или инфекции, включая недоедание, сгорбленную осанку и взъерошенную шерсть. Через две недели после операции должно произойти снятие швов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наносите эритромициновую мазь на раневую поверхность каждый день в течение трех дней подряд.
3. Если наблюдаются какие-либо осложнения, такие как отек раны, это должно быть немедленно устранено.

6. Поведенческий анализ

Примечание: Все поведенческие тесты и анализ проводились наблюдателем, слепым к экспериментальным группам.

1. Испытание цилиндра
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цилиндрический тест оценивает использование передних конечностей во время спонтанного вертикального исследования внутри цилиндра через 4 и 8 недель после операции²¹.
   1. Поместите мышей в прозрачный цилиндр (диаметр 9 см, высота 15 см) на приподнятой раме.
   2. Для облегчения наблюдения и записи закрепите зеркало под углом 45° под цилиндром.
   3. Запишите спонтанное вставание на дыбы каждой мыши, наблюдаемой с помощью зеркала, в течение 10 минут.
      1. Вручную определите время, в течение которого (i) правая лапа, (ii) левая лапа или (iii) обе лапы соприкасались со стеклянными стенками. Начитайте в общей сложности 20 движений во время каждого сеанса. Исключите из анализа мышей, которые не были активны во время теста.
   4. Оцените производительность теста следующим образом:
      
2. Тест обхода сетки
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тест на ходьбу по сетке оценивает точное положение передних лап на перекладинах сетки во время спонтанного исследования через 4 и 8 недель после операции. ²². См.
   1. Поместите мышей на проволочную сетку (20 см x 24 см) с квадратными отверстиями 25 мм и дайте им свободно исследовать в течение 10 минут, записывая их выступление на видеокамеру.
   2. Засчитайте скольжение ноги в одном из следующих случаев:
      1. Обратите внимание на случаи, когда лапа полностью пропускает перекладину (в этом случае конечность попадает между перекладинами, и животное теряет равновесие).
      2. Обратите внимание на случаи, когда лапа правильно поставлена на перекладину, но соскальзывает под действием веса тела.
   3. Выразите результат теста как скольжение стопы правой передней конечности / полное скольжение стопы. Несмотря на то, что ни тест на цилиндр, ни тест на ходьбу по сетке не требуют обучения, получите исходные баллы, проверив каждое животное один раз перед операцией.

Результаты

Односторонняя черепно-мозговая травма часто вызывает стойкую дисфункцию контралатеральной конечности из-за ограничений компенсаторной нейронной пластичности у взрослых^10,11. Ранее мы сообщали, что операция CC7 может быть использована для лечения гемиплегии верхних конечностей у взрослых пациентов после черепно-мозговой травмы⁷. Для оценки эффективности протокола прямого анастомоза двусторонних нервов С7 преспинальным путем нами была проведена операция перекрестного переноса нерва у мышей после односторонней черепно-мозговой травмы (ЧМТ). На рисунке 1 описаны процедуры ЧМТ и проверен диапазон повреждений и эффект. Во-первых, для повреждения коры головного мозга левого полушария (переднезадний = +1,0 мм до -2,0 мм, медиолатеральный = от 0,5 мм до 3,5 мм) у взрослых мышей был использован электрический кортикальный ударный импактор (eCCI), что привело к одностороннему повреждению головного мозга. Через 2 недели анатомические структуры подтвердили, что этот протокол ЧМТ почти разрушил сенсомоторную кору, важное место для инициирования движений. У этих мышей с односторонней ЧМТ наблюдались значительные двигательные дефекты правой передней конечности.

На рисунке 2 показаны процедуры CC7. Диаграмма траектории операции CC7 показала, что путь А, представляющий преспинальный путь, был кратчайшим по сравнению с другими. Длина пути А даже ниже, чем длина зажатого нерва С7 с левой стороны (непарализованной). Это открытие послужило анатомической основой для выбора преспинального маршрута для завершения операции по пересадке нерва. Операция CC7 проводилась в прямом анастомозе преспинальным путем через две недели после ЧМТ. Шейный 7-й (С7) нерв на непарализованной стороне был напрямую перенесен на парализованную сторону вместо того, чтобы создавать свои первоначальные мозговые связи. На рисунке 3 представлены результаты электронной микроскопии, которые показали, что перенесенный нерв С7 успешно регенерировал. Толщина миелиновой оболочки перенесенного нерва С7 постепенно увеличивалась, начиная с 4 недель после операции СС7, и была почти сопоставима с таковой в контрольной группе через 8 недель после операции СС7. На рисунке 4 показана реиннервация мышц перенесенного нерва С7 с помощью электромиографических записей. Электрическая стимуляция проксимального конца нервного анастомоза С7 стабильно индуцировала потенциалы действия в нескольких мышцах пораженной передней конечности через 4 недели после операции, что согласуется с результатами электронной микроскопии. На рисунке 5 показано, что перенесенный нерв С7 содержит двигательные волокна от вентрального рога и сенсорные волокна от ганглиев задних корешков сегмента спинного мозга С7 на здоровой стороне через ретроградное мечение субъединицей холерного токсина B (CTB).

На рисунке 6 показано, что мышиная модель также продемонстрировала значительное восстановление моторики после односторонней ЧМТ, что согласуется с результатами клинических исследований. Для верификации влияния операции CC7 на восстановление поврежденной двигательной функции после ЧМТ были созданы группы ЧМТ + Sham и Control + Sham. Мыши в группе ЧМТ + Симуляция и ЧМТ + СС7 получали одни и те же процедуры при травме ЧМТ одновременно, в то время как мыши в группе Контроль + Симуляция получали только фиктивную операцию. В то время как мыши в группе ЧМТ + CC7 получили операцию по пересадке нерва, мыши в группе ЧМТ + симуляция и контрольная группа подверглись двусторонней резекции шейного нерва 7 (C7). В тестах цилиндров группа ЧМТ + СС7 показала значительно более высокую частоту использования поврежденной передней конечности, чем группа ЧМТ как через 4, так и через 8 недель после операции СС7 (стр < 0,01). В тестах с ходьбой по сетке группа ЧМТ + CC7 показала более низкую частоту ошибок, чем группа ЧМТ через 4 недели после операции CC7. Более того, частота ошибок в группе ЧМТ + СС7 была значительно ниже, чем в группе ЧМТ через 8 недель после операции СС7 (р < 0,05). Эти поведенческие результаты показали, что операция CC7 может улучшить двигательную функцию пораженной конечности у мышей с ЧМТ. Вместе эти результаты свидетельствуют о том, что перенесенный нерв С7, восстановленный хирургическим вмешательством CC7 преспинальным путем, был успешно регенерирован и реиннервировал поврежденную переднюю конечность, способствуя восстановлению моторики у взрослых мышей с односторонней ЧМТ.

Рисунок 1: Характеристика односторонней черепно-мозговой травмы. (A) Схема, показывающая положение мыши в eCCI. (B) Параметры и диапазон повреждений eCCI. (C) Репрезентативный корональный срез, показывающий пораженную кору головного мозга (через 2 недели после ЧМТ, масштабная линейка = 500 мкм). Аббревиатура: eCCI = электрокортикальный контузионный импактор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Элементарная хирургическая схема. (A) Схематическая схема, показывающая схему эксперимента по выполнению контралатерального переноса нерва С7 у мышей с ЧМТ. Красным кружком показано положение травмы. Красная двойная косая черта внутри пунктирного прямоугольника показывает зашитый нерв. (Б) Поперечный срез показывает три альтернативных пути контралатерального переноса нерва С7 у мышей. Путь А, синяя линия изображает преспинальный путь перенесенного нерва; Путь В, зеленая линия, изображает претрахеальный путь перенесенного нерва; Путь С, красная линия, изображает подкожный туннель перенесенного нерва. (В) На графике показана длина маршрутов и собранный нерв С7 в (В). Длина пути А (3,3 ± 0,10 мм) была достоверно ниже длины зажатого нерва С7 (4,05 ± 0,11 мм; * p < 0,05, односторонняя ANOVA, n = 20 в каждой группе). Длина пути С (14,15 ± 0,20 мм) была достоверно больше, чем у изъятого нерва С7 (*** p < 0,001, односторонняя ANOVA, n = 20 в каждой группе). Длина пути B составила 4,2 ± 0,08 мм (n=20). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Электронно-микроскопический анализ поперечного сечения нерва. (A,B) Изображения нерва у контрольных мышей. Масштабная линейка = 5 мкм (A) и 1 мкм (B). (С,Д) Снимки регенерированного нерва через месяц после операции. Масштабная линейка = 5 мкм (C) и 1 мкм (D). (Е, Ф) Снимки регенерированного нерва в какой-то момент через пять месяцев после операции. Масштабная линейка = 5 мкм (E) и 1 мкм (F). (Г, Н) Снимок регенерированного нерва через два месяца после операции. Масштабная линейка = 5 мкм (G) и 1 мкм (H). Увеличение A, C, E и G, 2 000x; увеличение B, D, F и H, 15 000x. (I) G-коэффициент (отношение внутреннего и внешнего диаметра миелиновой оболочки) в образцах контрольной группы ниже, чем в образцах 4-недельного периода, и равен образцам через 6-8 недель после операции (***: p < 0,001; сравнение на разных аксонах группы с помощью t-критерия; n = 3 мыши в каждой группе). Сокращения: CC7 = контралатеральная пересадка седьмого шейного нерва; CC7-XW = X недель после операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Электромиографический анализ после контралатерального пересадки нерва С7 показывает скорость регенерации нерва. (A) Принципиальная схема, показывающая стимуляцию электронного переноса и запись электромиографии in vivo. Интенсивность стимуляции была одинаковой на протяжении всего теста (2 мА). Местом стимуляции является нерв С7, проксимальнее анастомоза. (В, В) Фотографии, демонстрирующие потенциал действия, зафиксированные в большой грудной мышце, через две недели (B) и четыре недели (C) после операции. (Г, Д) ЭМГ регистрировалась в разгибателях пальцев через 4 недели (D) и 8 недель (E) после операции. (F) Через три недели в трехглавой мышце плеча появились CMAP. (G) Через четыре и восемь недель КМАП трехглавой мышцы плеча увеличивались. (H) Средняя амплитуда большой грудной мышцы достигала ~0,25 мВ ± 0,16 мВ через 4 недели по сравнению с 0,45 мВ ± 0,03 мВ через 8 недель, что свидетельствует о существенной разнице между двумя временными точками (*** p < 0,001, t-критерий, n = 6 в каждой группе). (I) Средняя амплитуда трехглавой мышцы плеча достигала ~0,15 мВ ± 0,01 мВ через 4 недели по сравнению с 0,46 мВ ± 0,02 мВ через 8 недель, что свидетельствует о значимой разнице между двумя временными точками (***: p < 0,001, t-критерий, n = 6 в каждой группе). (J) Средняя амплитуда пальцевого разгибателя достигала ~0,11 мВ ± 0,01 мВ через 4 недели по сравнению с 0,29 мВ ± 0,02 мВ через 8 недель, что свидетельствует о достоверной разнице между двумя временными точками (***: p < 0,001, t-критерий, n = 6 в каждой группе). Сокращения: ЭМГ = электромиография; CMAP = потенциал действия составной мышцы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Ретроградное мечение двигательных и сенсорных нейронов перенесенного нерва С7. (А-С) СТВ вводили в дистальный конец нервного анастомоза С7 через 4 недели после операции СС7. (А) Сенсорные нейроны были помечены для DRG. (В, В) Двигательные нейроны перенесенного нерва С7 были помечены для спинномозгового переднего рога. Увеличение, 20х. Масштабная линейка = 200 мкм (A, B); 100 мкм (C). Сокращения: CTB = субъединица холерного токсина B; DRG = ганглий заднего корешка; DAPI = 4′,6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Изменения в поведении после операции CC7. (A) На изображениях показан цилиндрический тест мышей. (B) Сводный график, показывающий влияние переноса CC7 через 4 недели и 8 недель после операции на мышах с ЧМТ (n = 6 мышей). р = 0,001; Непарный t-критерий. Среднее использование поврежденных передних конечностей составило 54,17% ± 3,01% в группе Control + Sham по сравнению с 22,5% ± 2,14% в группе TBI + Sham; 35,83% ± 2,39% в группе ЧМТ + СС7 через 4 недели после операции СС7, что указывает на достоверную разницу (односторонняя ANOVA; p < 0,05, n = 6 в каждой группе). Через 8 недель после переноса CC7 использование составляло 53,33% ± 3,80%, 24,17% ± 3,01% и 40,00% ± 1,83% в контрольной группе + симуляция, группе ЧМТ + симуляция и ЧМТ + CC7 соответственно, что является значимой разницей (*p < 0,05, односторонний ANOVA, n = 6 в каждой группе). (C) На изображениях показан тест обхода сетки. (D) На графике видно, что средняя частота ошибок у поврежденных передних конечностей в группе ЧМТ + Симуляция составила 85,41% ± 1,59% (n = 6), что соответствует группе ЧМТ + СС7 80,17% ± 2,19% (n = 6), и обе группы были больше, чем в контрольной группе + Симуляция (50,99% ± 11,69%). Через 8 недель после операции частота ошибок в группе ЧМТ + СС7 составила 76,87 ± 1,07% (n = 6), что достоверно ниже, чем в группе ЧМТ + Симуляция (83,06% ± 1,41%; p < 0,05, односторонняя ANOVA, n = 6 в каждой группе). Сокращения: CC7 = контралатеральная пересадка седьмого шейного нерва; ЧМТ = черепно-мозговая травма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

В клинике операция по пересадке пересечения нерва используется для лечения пациентов с повреждением плечевого сплетения и после повреждений головного мозга, таких как инсульт и ЧМТ ^7,9,12. Примечательно, что повреждение головного мозга является тяжелым неврологическим заболеванием, которое может привести к нескольким осложнениям, включая эпилепсию, церебральную грыжу и инфекцию¹³. Не всем пациентам с односторонней травмой головного мозга подходит операция CC7. В целом, операция CC7 проводится пациентам с центральной гемиплегией на хронической стадии (через 6 месяцев после травмы), чтобы максимально избежать влияния отека мозга. Пациенты с когнитивными нарушениями и квадриплегией после черепно-мозговых травм исключаются из лечения операции CC7.

В большинстве исследований сообщалось об использовании подкожного доступа и анастомоза трансплантата сурального или локтевого нерва для переноса контралатерального нервного корешка C7^14,15. Однако регенерация нервов такими методами требует шести месяцев, что может затруднить процесс восстановления моторики и даже потенциально повлиять на пластичность мозга¹⁴. В предыдущих исследованиях контралатеральный перенос С7 выполнялся у крыс, и билатеральный нерв С7 использовался через 4 нити интерпозиционного аутотрансплантированного сурального нерва. Тем не менее, не было сообщений о переносе нерва C7 преспинальным путем у мышей. Мы выполнили операцию CC7 модифицированного преспинального пути у мышей и верифицировали скорость функционального восстановления после переноса нерва С7. В этом исследовании контралатеральный перенос нерва C7 через преспинальный путь улучшил функцию парализованной конечности через месяц после операции, что отражает более короткое время восстановления модели трансплантированного нерва животного. Таким образом, эта модель может точно смоделировать клинические ситуации и заложить основу для дальнейших экспериментов.

Как рассечь нервный корешок и снизить риск являются важными вопросами для переноса С7. В отличие от человека, плечевое сплетение мыши расположено в грудной клетке ниже ключицы ^5,16. Таким образом, стратегия доступа должна была быть изменена, чтобы обеспечить наблюдение за корнем нерва С7 и позвоночником¹⁷. Стернотомия является безопасным и эффективным хирургическим подходом и обычно применяется в экспериментах на мышах в кардиоторакальной хирургии^18,19. Вентральная пластинка С6 также является препятствием для передачи нервов. Таким образом, была проведена операция стернотомии для рассечения нервного корешка С7 и разрыва вентральной пластинки С6 для сокращения расстояния переноса.

Несмотря на то, что преспинальный путь может значительно увеличить вероятность успеха прямого анастомоза при операции по пересадке нервов, не все мыши могут быть анастомозированы напрямую. В основном это связано с анатомическими различиями у этих мышей. Средний ствол (нерв С7) сливается с верхним или нижним стволом в месте, очень близком к межпозвонковому отверстию. Таким образом, длина нервов С7, доступных для забора, недостаточна. В настоящее время единственным подходом является пересадка нерва или замена мышей. Эта модель обычно используется для 8-недельных мышей (20-25 г), так как мыши зрелые, а нервы C7 имеют достаточный размер, чтобы с ними можно было справиться. Хотя этот хирургический протокол применим и к молодым мышам, сложность операции значительно возрастет у более молодых мышей.

Двигательная функция передних конечностей мышей в группе ЧМТ + СС7 была значительно повышена через один месяц и два месяца, что позволяет предположить, что перенесенный нерв С7 способствовал восстановлению поврежденной передней конечности. Ремиелинизация имеет решающее значение для функционального восстановления нервной системы. Предыдущее исследование показало, что миелиновые оболочки поврежденных нервов регенерируют через один месяц, что согласуется с^{этими результатами}. Здесь перенесенный нерв постепенно созревал, что соответствовало поведенческому тесту. Электромиография была использована для дальнейшего изучения скорости функционального восстановления после пересадки нервов. Результаты показали, что пересаженный нерв иннервировал пораженную мышцу через 4 недели после операции. Примечательно, что в данном исследовании впервые определен временной момент реиннервации с прямым анастомозом после операции перекрестного переноса нерва.

Таким образом, мы смоделировали клиническую хирургию для создания протокола прямого анастомоза двусторонних нервов плечевого сплетения преспинальным путем у мышей и подтвердили функцию смещенного нерва. Мышиная модель способствовала выяснению нейронных механизмов, лежащих в основе реабилитации при перекрестном переносе нерва после травм центральной и периферической нервной системы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	KDL	K-20200808
12-0 nylon sutures	Chenghe	20082
5-0 silk braided	MERSILK,ETHICON	QK312
75% ethanol	GENERAL-REAGENT	P1762077
Acupuncture needle	Chengzhen	190420	Use for making retractors
Automatic clipper	Codos	CHC-332
C57BL/6N mice	SLAC laboratory (Shanghai)	C57BL/6Slac
Electrocautery	Gutta Cutter	SD-GG01
Erythromycin ointment	Baiyunshan	H1007
Iodophor disinfection solution	Lionser	20190220
Medical tape	Transpore,3M	1527C-0
Micro needle holder	Chenghe	X006-202003
Micro-forceps	Chenghe	B001-201908
Micro-scissors	66VT	1911-2S276
Operating microscope	OLYMPUS	SZX7
Ophthalmic scissor	Chenghe	X041D1251
Pentobarbital sodium	Sigma	20170608
Plastic infusion tube	KDL	C-20191225
Sterile normal saline	KL	L121021109
Vascular forceps	Jinzhong	J31020
Warming pad	RWD	69027