JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен протокол эффективного и точного скрининга генотипов табака на устойчивость Phytophthora nicotianae у саженцев. Это практический подход к точному разведению, а также исследованию молекулярного механизма.

Аннотация

Черная голяшка, вызванная оомицетами Phytophthora nicotianae, губительна для табака, и этот патоген высокопатогенен для многих пасленовых культур. P. nicotianae хорошо приспособлен к высоким температурам; поэтому исследования этого патогена приобретают все большее значение в сельском хозяйстве во всем мире из-за глобального потепления. Устойчивые к P. nicotianae сорта табачных растений обычно проверяются путем инокуляции овсяными зернами, колонизированными P. nicotianae , и мониторинга симптомов заболевания. Тем не менее, трудно количественно оценить интенсивность прививки, поскольку точная инокуляция имеет решающее значение в этом случае. Данное исследование было направлено на разработку эффективного и надежного метода оценки устойчивости табака к инфекции P. nicotianae. Этот метод был успешно использован для идентификации резистентных сортов, а эффективность инокуляции была подтверждена ПЦР в режиме реального времени. Метод оценки резистентности, представленный в этом исследовании, является эффективным и практичным для точного разведения, а также исследования молекулярного механизма.

Введение

P. nicotianae губителен для многих пасленовых культур. Он может вызвать табачную «черную голяшку»1, картофельную лиственную и клубневую гниль2, корону томата и сладкого перца и корневую гниль3, а также ошейник годжи и корневую гниль4. P. nicotianae может атаковать все части табачных растений, включая корни, стебли и листья на любой стадии роста5. Наиболее распространенным симптомом заболевания является черное основание стебля. Корни первоначально видны как пропитанные водой, а затем становятся некротическими, а листья показывают большие круговые поражения5. Это заболевание может быть разрушительным для табачного растения в теплице, а также в поле6. Наиболее практичным и экономичным методом борьбы с P. nicotianae является использование устойчивых сортов7. Однако для идентификации устойчивых к P. nicotianae соединений из коллекций зародышевой плазмы табака требуется эффективный протокол скрининга.

Были описаны различные методы идентификации для оценки устойчивости P. nicotianae у табака7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. В целом для идентификации генотипов табака, устойчивых к P. nicotianae, использовались три основных подхода. Первый включает смешивание мицелия с агаровой средой на пластинах Петри, содержащих P. nicotianae. Затем мицелий культивируют в темноте при комнатной температуре в течение 2 недель. 1 л деионизированной воды добавляют в мицелий и гомогенизируют в течение 30 с. Инокулят держат на льду до тех пор, пока это не понадобится. С каждой стороны растения делают по два отверстия (диаметром 1 см и глубиной 4-5 см), и в каждое отверстие заливается 10 мл инокулята. Затем отверстия заполняются окружающей почвой, а развитие болезни контролируется ежедневно в течение 2 недель8,10.

Во втором способе растения прививают зараженными патогенами зубочистками. Для такого подхода растения следует использовать примерно через 6 недель после пересадки и должны иметь минимальную высоту 30 см. Автоклавные зубочистки размещают на поверхности культур, содержащих мицелий P. nicotianae. Затем блюда для культуры хранят при свете при комнатной температуре в течение 7 дней. Затем колонизированные зубочистки используются для вакцинации растений. Зубочистки вставляются в стебли табака между четвертым и пятым узлами. Растения контролируются ежедневно в течение 5 дней9,15. Этот метод не применим для мелких саженцев. Поскольку инокулятив является зараженным патогенами зубочистками, интенсивность прививки не может точно контролироваться.

Наиболее часто используемый подход включает в себя зерна овса для прививки. В этом случае зерна овса готовят путем автоклавирования 500 мл овса и 300 мл деионизированной воды при 121 °С в течение 1 ч один раз в сутки в течение 3 дней. Затем зерна овса добавляют в колонизированную патогенами культуральную среду. Посуду запечатывают парафиновой пленкой и инкубируют при 25 °C при свете в течение 7-12 дней. На почве для горшков делаются четыре отдельных отверстия глубиной 5 см, по 4 см от каждого растения, и в каждое отверстие помещается одно зараженное патогенами зерно овса. Инкубационный период определяется исходя из того, когда возникает первый надземный симптом7,11,12,13,14,15,16. Этот метод эффективен и применим для крупномасштабного скрининга сопротивления. Однако одним из ограничений этого подхода является то, что инокулят является зараженным патогенами зернами овса, поэтому интенсивность прививки не может точно контролироваться.

Однако здесь представлен более точный метод, который применим к оценке сопротивления камеры роста. По сравнению с другими подходами, инокулятум представляет собой зооспоровую суспензию, поэтому интенсивность прививки контролируется и регулируется. Поскольку растения табака в этом исследовании культивируются без почвы, результаты легче наблюдать. Кроме того, отбор проб корней растений из почвы всегда приводит к повреждению корней, что вызывает ряд физиологических реакций17. В этом методе, поскольку растения культивируются без почвы, вмешательство в повреждение корней может быть устранено. В заключение, этот метод более практичен для исследования молекулярных механизмов и точного разведения. Используя этот протокол, данные обычно получаются в течение 5 дней, при этом более 200 растений оцениваются в одном эксперименте.

протокол

1. Материалы

  1. Получают сорта табака.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента "Beinhart1000-1" (выборка Beinhart 1000) (BH) и "Xiaohuangjin1025" (XHJ) были получены из Национального среднесрочного генбанка ресурса зародышевой плазмы табака Китая. BH устойчив, тогда как XHJ восприимчив к инфекции P. nicotianae16. Полевой изолят расы P. nicotianae 0, который сохранился в Научно-исследовательском институте табака Китайской академии сельскохозяйственных наук, использовался для всех прививок на протяжении всего исследования.

2. Посадка генотипов табака для оценки устойчивости к P. nicotianae

  1. Смешайте семена табака с вермикулитом и аккуратно распределите семена на стерилизованную почву для горшков. Поместите горшки в камеру роста. Поддерживайте постоянную температуру 25 °C, при 16 ч света/8 ч темного фотопериода.
  2. Подготовьте гидропонные устройства с лотками и пенопластовыми листами. После того, как семена прорастут, выколите рассаду из горшечной почвы, осторожно промойте корни стерильной деионизированной водой и пересадите их в гидропонные устройства.
  3. Поместите приборы в климатические камеры при температуре 25 °C при 16-часовом свете/8 ч темного фотопериода в течение 24 ч.
  4. Заранее приготовьте питательный раствор Hoagland (таблица 1). Пересадите рассаду на гидропонные устройства питательным раствором Hoagland (примерно 125 мл на растение).
  5. Поместите приборы в климатическую камеру при температуре 25 °C при 16-часовом свете/8 ч темного фотопериода на 2 недели.

3. Приготовление суспензии зооспоры P. nicotianae

  1. Приготовить овсяный агар средней.
    1. Взвесьте 33 г овсянки и переложите на стеклянную посуду и добавьте 1000 мл стерильной воды. Варить на электромагнитной плите духовке.
    2. После того, как овсянка станет липкой, процедите жидкий раствор через кусочек стерильной марли.
    3. Налейте жидкий раствор в градуированный цилиндр объемом 1000 мл и отрегулируйте объем до 1000 мл стерильной водой.
    4. Налейте жидкий раствор в стеклянный флакон с реагентом и добавьте 18 г агара. Хорошо встряхните и автоклавируйте смесь (овсяную агаровую среду) при 121 °C в течение 15 мин. Оставьте при комнатной температуре на 30 мин.
    5. Налейте около 20 мл стерилизованной овсяной агаровой среды в каждую чашку Петри. Оставьте чашку Петри при комнатной температуре тщательно остыть перед культивированием мицелиальности.
  2. Проводят мицелиальную культивацию.
    1. Заранее подготовьте перфораторы и зубочистки диаметром 1 см, автоклавировав их при 121 °C в течение 15 мин.
    2. Проделайте отверстия в культурах мицелиального агара P. nicotianae , чтобы сделать круглые мицелиальные маты.
    3. Выделите мицелиальные маты, поместите мицелиальную сторону вниз на овсяную агаровую среду и инкубируйте мицелий при 25 °C в темноте в течение 14 дней.
  3. Приготовить суспензию зооспоры P. nicotianae .
    1. Добавляйте 0,1% раствор KNO3 к каждой культивации мицелиала (15 мл/блюдо) с последующим культивированием при 4 °C в течение 20 мин для индуцирования спорангия.
    2. Держите блюда при температуре 25 °C в течение 25 минут, чтобы освободить зооспоры.
    3. Соберите суспензию зооспоры в стакан и измерьте концентрацию зооспоры с помощью микроскопа и гемоцитометра.
    4. Отрегулируйте концентрацию зооспоры до 1 x 104 зооспор/мл со стерильной водой.

4. Идентификация устойчивых к болезням сортов табака

  1. Возьмите рассаду из питательного раствора Hoagland и привите их, погружая корни в 20 мл суспензии зооспоры P. nicotianae в чашку Петри (90 мм) при 25 °C в течение 3 ч в темноте.
  2. После прививки поместите саженцы табака в новые чашки Петри с 10 мл стерильной воды, погружающей корни. Держите корни влажными, покрыв двумя кусочками фильтровальной бумаги. Держите посуду при температуре 25 °C с 16-часовым светлым/ 8-часовым темным фотопериодом.
  3. Через 2-3 дня наблюдают тяжесть заболевания.
    1. Для контрольной обработки поместите саженцы табака непосредственно в чашку Петри со 10 мл стерильной воды, погружающей корни, и накройте корни двумя кусочками фильтровальной бумаги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая обработка имела три репликации, с 8 растениями в эксперименте.

5. Оценка инфекции P. nicotianae

  1. Оценить тяжесть заболевания через 4-5 дней после прививки. Основываясь на китайском национальном стандарте18, оценивайте тяжесть отдельных заболеваний растений по шкале от 0 до 9 (таблица 2, рисунок 1).
  2. Рассчитайте индекс заболеваемости по следующей формуле18:
    Индекс заболевания = figure-protocol-5110
    где a, b, c, d, e и f — количество растений в каждой степени тяжести заболевания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тяжесть заболевания была разделена на 6 степеней18 (табл. 3).

Результаты

4-недельным растениям резистентного сорта BH и восприимчивого сорта XHJ был брошен вызов P. nicotianae с использованием метода, представленного в этой статье. Эксперимент был разработан с тремя репликами, каждая с 8 растениями на группу. Инфекция P. nicotianae двух разновидностей табака, BH и...

Обсуждение

Многочисленные источники резистентности были использованы для улучшения устойчивости P. nicotianae в культивируемом табаке. Одиночные доминантные гены R, Php и Phl, были интрогрессированы из Nicotiana plumbaginifolia и Nicotiana longiflora, соответственно10. Сорт сигарного таба?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование финансировалось Национальным фондом естественных наук Китая (31571738) и Инновационной программой сельскохозяйственной науки и техники Китая (ASTIP-TRIC01).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
(NH4)2SO4Sinopharm10002917Analytical Reagent
(NH4)6 Mo7O24•2 H2OSinopharmXW131067681Analytical Reagent
1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge TubesEppendorf30120086Used for Sample Extarction
2 ml Safe-lock Microcentrifuge TubesEppendorf30120094Used for Sample Extarction
AgarMDBio, Inc9002-18-0Materials of Culture Medium
Analytical BalanceAOHAOSIAX2202ZHEquipment
AutoclaveYamatuoSQ510CEquipment
AutoclaveYAMATUOSQ510CEquipment
BeakerBio BestDHSB-2LMaterials of Culture Medium
Biological IncubatorJINGHONGSHP-250Equipment
Ca(NO3)2•4 H2OSinopharm80029062Analytical Reagent
CaCl2Sinopharm10005817Analytical Reagent
CuSO4•5 H2OSinopharm10008218Analytical Reagent
Electromagnetic OvenBio BestDHDCLEquipment
FeSO4•7 H2OSinopharm10002918Analytical Reagent
Filter PaperBio BestDHLZ-9CMMaterial
Fluorescence Ration PCR InstrumentRocheLightCycler96Equipment
GauzeBio Best17071202Materials of Culture Medium
H3BO3PhytotechnologyB210-500GAnalytical Reagent
HemocytometerSolarbio17072801Material for disease-resistant  identification
K2SO4Sinopharm10017918Analytical Reagent
KNO3Sinopharm10017218Analytical Reagent
KT Foam SheetBio BestDHKTBMaterial for Seedling
Low Constant IncubatorJinghongSHP-250Equipment
Measuring CylinderBio BestDHBLLT-1000MLMaterials of Culture Medium
MgSO4•7 H2OSinopharm10013080Analytical Reagent
MicroscopeECHORVL-100-GEquipment
MnCl2•4 H2OSinopharmG5468154Analytical Reagent
Na2-EDTASinopharmG21410-250Analytical Reagent
NaH2PO4•2 H2OSinopharm20040717Analytical Reagent
NH4NO3SinopharmB64586-100gAnalytical Reagent
OatmealBio BestDHYMP-1.5KGMaterials of Culture Medium
Petri DishBio BestDHPYM-9CMMaterial for disease-resistant  identification
PipettorTHERMOS1Equipment
PottingBio BestDHYCXHP-12CMMaterial for Seedling
Potting SoilBio BestDHYMJZ-50LSeedling Material
PunchBio BestDHDKWMaterial
qRT-PCR PlateMonadMQ50401SqRT-PCR Plate
SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR KitAccurate BiologyAG11718PCR Reagent
ToothpickBio BestDHYQ-900Material
Total RNA Kit IIOmegaR6934-01PCR Reagent
TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMixTransgenAH311-02PCR Reagent
TraysBio BestDHYMTP-90GMaterial for Seedling
VermiculiteBio BestDHZSSeedling Material
Water Purification SystemHEAL FORCEHSE68-2Equipment
ZnSO4•7 H2OSinopharm10024018Analytical Reagent

Ссылки

  1. Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco. Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).
  2. Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates. Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).
  3. Amalia, B. R., José, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper. European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).
  4. Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum. Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).
  5. Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen. Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).
  6. Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers. Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).
  7. Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae. Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).
  8. Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold. Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).
  9. Csinos, A. S. Stem and root resistance to tobacco black shank. Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).
  10. Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold. Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).
  11. Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).
  12. Hernández, I., et al. Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).
  13. Vontimitta, V., Lewis, R. S. Growth chamber evaluation of a tobacco 'Beinhart 1000' × 'Hicks' mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae. Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).
  14. Xiao, B., et al. Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301. Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).
  15. McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000. Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).
  16. Zhang, Y., et al. Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1. The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).
  17. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
  18. Ren, G., et al. . GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , (2008).
  19. Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).
  20. Yan, H. Z., Liou, R. F. Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica. Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).
  21. Chacón, O., Hernández, I., Portieles, R., López, Y., Pujol, M., Borrás-Hidalgo, O. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).
  22. Vijay, V., Ramsey, S. L. Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000. Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).
  23. McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco. Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).
  24. Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region. Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).
  25. Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabières, F., Berre, J. -. Y. L., Gourgues, M. Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration. New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).
  26. Huang, G., et al. An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants. Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).
  27. Agnès, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -. T., Harald, K. The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection. New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182Phytophthora nicotianae

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены