Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем и демонстрируем протокол первичной изоляции синусоидальных эндотелиальных клеток печени мыши (LSEC). Протокол основан на перфузии коллагеназы печени, непаренхимальной очистке клеток низкоскоростной центрифугированием и выборе магнитных шариков CD146. Мы также фенотипируем и характеризуем эти изолированные ЛСЭК с помощью проточной цитометрии и сканирующей электронной микроскопии.

Аннотация

Синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSECs) представляют собой специализированные эндотелиальные клетки, расположенные на границе между кровообращением и паренхимой печени. ЛСЭС имеют отчетливую морфологию, характеризующуюся наличием фенестрат и отсутствием базальной мембраны. ЛСЭС играют важную роль во многих патологических расстройствах печени, включая метаболическую дисрегуляцию, воспаление, фиброз, ангиогенез и канцерогенез. Тем не менее, мало что было опубликовано об изоляции и характеристике LSEC. Здесь в этом протоколе обсуждается изоляция LSEC как от здоровых, так и от неалкогольных мышей с жировой болезнью печени (НАЖБП). Протокол основан на перфузии коллагеназы печени мыши и магнитном отборе непаренхимальных клеток для очистки ЛСЭС. Это исследование характеризует ЛСЭС с использованием специфических маркеров с помощью проточной цитометрии и идентифицирует характерные фенотипические особенности с помощью сканирующей электронной микроскопии. ЛСЭС, выделенные в соответствии с этим протоколом, могут использоваться для функциональных исследований, включая анализы адгезии и проницаемости, а также для последующих исследований для конкретного пути, представляющего интерес. Кроме того, эти ЛСЭС могут быть объединены или использованы по отдельности, что позволяет генерировать мультиомные данные, включая объемную или одноклеточную РНК-seq, протеомную или фосфопротеомику и анализ на транспозазно-доступный хроматин с использованием секвенирования (ATAC-seq), среди прочих. Этот протокол будет полезен для исследователей, изучающих связь LSECs с другими клетками печени в области здоровья и болезни, и позволит глубоко понять роль LSECs в патогенных механизмах острого и хронического повреждения печени.

Введение

Синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSECs) выстилают стенки синусоиды печени и являются наиболее распространенными непаренхимальными клетками в печени1. ЛСЭС отличаются от других капиллярных эндотелиальных клеток в других частях тела наличием фенестр и отсутствием классической базальной мембраны или диафрагмы 2,3. Следовательно, ЛСЭС обладают отличительными фенотипическими и структурными характеристиками, которые повышают их проницаемость и эндоцитарную способность устранять различные циркулирующие макромолекулы, включая липиды и липопротеины. LSECs играют ключевую роль в перекрестных помехах между паренхиматозными и непаренхимальными клетками, такими как звездчатые клетки и иммунные клетки. ЛСЭС играют ключевую роль в поддержании гомеостаза печени, сохраняя звездчатые клетки и клетки Купфера в состоянии покоя4. ЛСЭС модулируют состав популяций печеночных иммунных клеток, опосредуя адгезию и трансэндотелиальную миграцию циркулирующих лейкоцитов 5,6. Во время острого и хронического повреждения печени7, включая ишемию-реперфузионное повреждение (IRI)8, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ)9 и гепатоцеллюлярную карциному (ГЦК), ЛСЭС подвергаются фенотипическим изменениям, известным как капилляризация, характеризующаяся дефенестрацией и образованием базальной мембраны10. Эти фенотипические изменения в ЛСЭС связаны с дисфункцией ЛСЭС и приобретением протромботических, провоспалительных и профиброгенных свойств.

Было разработано несколько методов выделения ЛСЭС из печени мышей11. Некоторые методы зависят от разделения непаренхимальных и паренхиматозных клеток с последующим центрифугированием градиента плотности для очистки LSECs от непаренхимальных фракций. Ограничением этого метода является наличие загрязняющих макрофагов на заключительных этапах выделения ЛСЭС, что может повлиять на чистоту изолированных ЛСЭС12. Этот протокол основан на перфузии коллагеназы печени мыши и положительном отборе магнитных шариков CD146+ непаренхимальных клеток для очистки ЛСЭС. ЛСЭС, выделенные с помощью этого метода, демонстрируют высокую чистоту и сохраненную морфологию и жизнеспособность. Эти ЛСЭС являются оптимальными для функциональных исследований, включая анализ проницаемости и адгезии, а также для последующих исследований интересующих путей. Кроме того, с растущим интересом к созданию больших наборов данных как в клинических исследованиях, так и в науке об открытиях, эти высококачественные ЛСЭС, выделенные как из здоровой, так и из больной печени с неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ) или другими состояниями, могут объединяться или использоваться индивидуально, что позволяет генерировать мультиомические данные и сравнивать здоровье и заболевание13,14 . Кроме того, изолированные ЛСЭС могут быть использованы для разработки двумерных, а также трехмерных моделей in vitro, таких как органоиды, для расшифровки активированного сигнального пути в ЛСЭС и их межклеточной связи с другими клетками печени при различных вредных стимулах и в ответ на различные терапевтические вмешательства.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Протоколы для животных были проведены в соответствии с одобрением Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) клиники Майо. Восьминедельные самцы мышей C57BL/6J были приобретены в лаборатории Джексона. Мышей помещали в 12:12-часовой цикл со свободным доступом к диете с контролируемой температурой.

1. Приготовление блюда или тарелки для культуры, покрытой коллагеном

  1. Чтобы получить 50 мл 0,02 моль/л уксусной кислоты, добавьте 0,6 мл ледниковой уксусной кислоты к 49,4 млH2O.
  2. Получите 50 мкг/мл коллагена I типа в 0,02 моль/л уксусной кислоты. Разбавление зависит от концентрации партии.
  3. Обмазать 10 см культуральную посуду 3 мл раствора коллагена. Инкубировать при комнатной температуре (РТ) в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании другой посуды или тарелки для культивирования объем раствора покрытия необходимо регулировать в зависимости от площади культивирования, обычно используют 6-10 мкг/см2.
  4. Удалите лишнюю жидкость с поверхности, покрытой покрытием, и промыть фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) 3 раза. Дайте посуде высохнуть на воздухе.
  5. Если раствор коллагена не стерилен, стерилизуйте посуду, покрытую коллагеном, воздействием ультрафиолетового (УФ) света в течение 10 мин в стерильной культуральной вытяжке.

2. Настройка оборудования

  1. Установите нагретый и увлажненный рециркуляционный перфузионный аппарат, как показано на рисунке 1B.
  2. Промойте перфузионную систему с использованием 10% отбеливателя в течение 5 минут, а затем стерильной водой еще 10 минут.
  3. Слейте промывочную жидкость как можно больше перед перфузией раствора коллагеназы.
  4. Вводят раствор коллагеназы через перфузионную систему (как показано на рисунке 1B) для предварительного нагревания при 37 °C. Установите скорость насоса на скорости 1, как показано на регуляторе скорости (равно 40 мл/мин).
  5. Держите эту скорость одинаковой на протяжении всей процедуры. Повторно используйте раствор коллагеназы, работающий в замкнутом контуре в течение дня изоляции LSEC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость насоса фиксируется на уровне 1, чтобы избежать механического давления, которое может нарушить биологическое состояние LSECs.

3. Хирургическая процедура

  1. Взвесьте мышь.
  2. Вводят 90 мг/кг массы тела кетамина и 10 мг/кг массы тела ксилазина внутрибрюшинно (ИП).
  3. Как только мышь нереактивна к болевым раздражителям, закрепите мышь на хирургической поверхности, как показано на рисунке 1B.
  4. Опрыскивайте брюшко мыши 70% этанолом. Используя хирургические ножницы, сделайте разрез длиной ~5 см, начиная от нижней части живота до мечевидного отростка.
  5. Затем сделайте два боковых разреза, используя небольшие ножницы радужной оболочки с каждой стороны живота, чтобы полностью обнажить органы брюшной полости.
  6. Поместите оболочку внутривенного (IV) катетера под спину животного, чтобы поднять и выровнять живот.
  7. Используя обычную изогнутую повязку щипцами, аккуратно оттяните кишечник и желудок влево от животного.
  8. Поместите хирургический шов 5-0 под нижнюю полую вену (IVC) чуть ниже открытой левой почки. Завяжите свободную сцепку в шов.
  9. Поместите еще 5-0 хирургический шов вокруг печеночной воротной вены (PV) чуть выше точки ветвления селезеночной вены от печеночной PV. Завяжите свободную сцепку в шов.
  10. Используя pv шов в качестве натяжения, вставьте катетер 20 G IV в печеночный PV на 1 см ниже, где он разветвляется на правый и левый печеночный PV.
  11. Сдвиньте катетер вверх по вене, но держите его ниже области ветвления. Позвольте крови пройти вниз по катетеру, пока она не начнет капать.
  12. С частью буфера А (таблица 1) во внутривенном (IV) флаконе, расположенном над хирургической областью, используйте линию IV и прикрепите ее к катетеру. Промывайте печень этим раствором, избегая попадания воздуха в систему.
  13. Завяжите шов вокруг нижней полой вены ниже почки. Это позволит печени ретро перфузировать.
  14. Отрежьте IVC ниже шва, чтобы животное истекало кровью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен быстро, чтобы избежать застойных явлений в печени.
  15. Закрепите внутривенный катетер швом PV.
  16. После перфузии отрежьте желудок, кишечник, селезенку и другие внутренности, прикрепленные к печени.
  17. Отрежьте диафрагму и крупные сосуды от грудной полости. Извлеките печень у животного и поместите ее на перфузионный лоток.
  18. Осторожно удалите внутривенную линию и подключите раствор коллагеназы в рециркуляционную камеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.16-3.18 должны быть выполнены в течение 5 минут, чтобы печень не была перфузирована слишком долго с буфером А. Будьте очень осторожны, чтобы не допустить пузырьков воздуха в печень.
  19. Дайте печени перфузиться до тех пор, пока капсула не станет пятнистой и не появится кашицеобразной (10-15 мин или более, период варьируется в зависимости от разных партий коллагеназы).
  20. Пока печень находится в перфузии, убедитесь, что животное умерло, прежде чем утилизировать его в мешок для некропсии.
  21. После переваривания извлеките печень из камеры и поместите ее в чашку Петри размером 10 см с примерно 20 мл безымянного Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  22. Аккуратно разберите печень парой кончиков пипетки и выбросьте билиарное дерево.
  23. Фильтруйте суспензию печени через клеточный ситечко 70 мкм в коническую трубку объемом 50 мл.
  24. Центрифугируют клеточную суспензию при 50 х г в течение 2 мин при РТ. Собирают супернатант, содержащий непаренхимальные печеночные клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гепатоциты осаждаются в грануле, которая может быть дополнительно очищена с использованием градиентного центрифугирования, как описано ранее15.

4. Разделение непаренхимальных печеночных клеток и очистка ЛСЭС

ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите CD146+ ЛСЭК с помощью иммуномагнитных шариков, следуя инструкциям производителя.

  1. Центрифугировать супернатант при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  2. Соберите гранулу ячейки и повторно суспендируйте в 1 мл изоляционного буфера (табл. 1), определите номер ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек в соответствии с инструкциями производителя.
  3. Центрифугируют клеточную суспензию при 300 х г в течение 10 мин при 4 °С, полностью аспирируют супернатант.
  4. Повторно суспендировать гранулу с 90 мкл изоляционного буфера на 107 общих клеток.
  5. Добавьте 10 мкл магнитных шариков CD146 на 107 общих ячеек. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 4 °C.
  6. Для промывки клеток добавляют 1-2 мл изоляционного буфера на 107 клеток, центрифугу при 300 х г в течение 10 мин, а затем полностью аспирируют супернатант.
  7. Повторное суспендирование до 109 клеток в 500 мкл изоляционного буфера (табл. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для более высоких чисел ячеек соответственно увеличьте объем буфера.
  8. Подготовьте разделительную колонну, промойте ее 3 мл изоляционного буфера.
  9. Нанесите суспензию ячейки на колонну, уложенную фильтрами предварительного разделения 70 мкм.
  10. Промыть колонну 3 мл изоляционного буфера 3 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При промывке колонны изоляционный буфер должен быть добавлен, как только резервуар колонны опустеет.
  11. Извлеките колонну из сепаратора и поместите ее на трубку центрифуги объемом 15 мл. Пипетка 5 мл изоляционного буфера на колонку.
  12. Чтобы восстановить магнитные шарики, помеченные ячейками, плотно протолкните поршень в колонну, чтобы промыть ячейки.
  13. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C. ЛСЭС готовы к микроскопическому исследованию и последующему анализу.

5. Иммунофенотипирование и оценка чистоты ЛСЭС методом проточной цитометрии

  1. Определите номера ячеек изолированных ЛСЭС с помощью автоматического счетчика ячеек в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Центрифугируйте клетки при 300 х г в течение 5 мин, полностью аспирируйте супернатант.
  3. Взять 1 х 106 клеток/пробирку и повторно суспендировать с 90 мкл окрашивающего буфера (таблица 1).
  4. Добавьте 10 мкл/пробирку мышиного блока FcR и 1 мкл красителя жизнеспособности, инкубируют при 4 °C в течение 10 мин.
  5. Окрашивают клетки комбинацией антител CD45, CD146 и стабилина-2, разведенных в 1:50 с буфером окрашивания. Инкубировать при 4 °C в течение 20 мин.
  6. Промыть клетки 5 мл окрашивающего буфера и центрифуги при 300 х г в течение 10 мин, затем полностью аспирировать супернатант.
  7. Повторно суспендируйте клетки с 300 мкл окрашивающего буфера и пропустите через проточный цитометр.

6. Культура и экспертиза LSECs

  1. Семена 1 х 106 клеток / хорошо в 6-луночной пластине и культивируют ее средой роста эндотелиальных клеток, состоящей из 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% добавки для роста эндотелиальных клеток и 1% раствора примоцина.
  2. Исследуйте изолированные ЛСЭС с помощью световой микроскопии. Получайте изображения яркого поля с 10-кратным увеличением.

7. Морфология ЛСЭС и исследование фенестр методом сканирующей электронной микроскопии

  1. Предварительно обмазывайте вставки клеточной культуры (размер пор 3 мкм) раствором коллагена.
  2. Культивируют изолированные ЛСЭС (120 000 клеток) на вставке с эндотелиальными клетками питательной среды в 24-луночной пластине при 37 °C теплой и увлажненной атмосфере. Дайте клеткам отстояться и прилипнуть в течение 2 ч.
  3. Для фиксации клеток добавьте эквивалентный объем предварительно расплавленного при 37 °C фиксатора Трампа к среде клеточной культуры.
  4. После инкубации в течение 10 минут замените 50% разбавленного фиксатора Трампа на неразбавленный фиксатор Трампа.
  5. Зафиксируйте клетки в фиксаторе Трампа в течение 2 ч, затем инкубируйте в течение 1 ч в 1% тетроксидов осмия.
  6. Приступайте к обезвоживанию образцов, сушке в сушильном устройстве критической точки, монтажу, напылению покрытия и исследованию с помощью сканирующего электронного микроскопа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Экспериментальные схемы и наладка оборудования:
В этом протоколе печень мыши переваривали с помощью замкнутого перфузионного контура, затем непаренхимальные клетки и гепатоциты отделяли низкоскоростным центрифугированием при 50 х г в течение 2 мин. Первичные ЛСЭС были ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В текущей рукописи мы описываем протокол изоляции LSEC из печени мыши, состоящий из двухступенчатой перфузии коллагеназы и последующей магнитно-активированной сортировки клеток (MACS). Этот протокол состоит из следующих трех этапов: (1) перфузия через PV с буфером без кальция с последующим б...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У всех авторов нет конфликтов для раскрытия.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварительной системы и почек NIH (1RO1DK122948 to SHI) и NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 grant mechanism (DK084567). Поддержку КФ оказывали также зарубежные исследовательские стипендии Японского общества содействия развитию науки (JSPS). Мы также хотели бы поблагодарить доктора Грегори Горса и Стивена Бронка за их оригинальный дизайн и оптимизацию аппарата перфузии коллагеназы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheterTerumo, SOmerset, NJ, USASR-OX2051CA
2–3-inch perfuion tray with a hole in the centercustomized; made in house
405/520 viability dyeMiltenyi, Bergisch Gladbach, Germany130-110-205
4-inch regular curved dressing forcepsFisher BrandFS16-100-110
5-0 Perma-Hand silk sutureEthicon, Raritan, NJ, USAA182H
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488MBL International, Woburn, MA, USAD317-A48
BSA stockMiltenyi, Bergisch Gladbach, Germany130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouseMiltenyi, Bergisch Gladbach, Germany130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouseMiltenyi, Bergisch Gladbach, Germany130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouseMiltenyi, Bergisch Gladbach, Germany130-110-803
Collagen type ICorning, Corning, NY, USA354236
Collagenase IIGibco, Waltham, MA, USA17101-015
Endothelial cells growth mediumScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA211-500
FcR blocking reagent, mouseMiltenyi, Bergisch Gladbach, Germany130-092-575
FlowJo software, version 10.6Becton, Dickinson and Company
Hardened Fine scissorsF.S.T, Foster city, CA, USA14091-11
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.customized; made in house
Hitachi S 4700 scanning electron microscopeHitachi Inc, Pleasanton, CA, USASEM096
LS columnsMiltenyi, Bergisch Gladbach, Germany130-042-401
MACS pre-separation filters (70 μm)Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany130-095-823
MACS rinsing bufferMiltenyi, Bergisch Gladbach, Germany130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μm)Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany130-098-462
MACSQunt flow cytometerMiltenyi, Bergisch Gladbach, Germany
Millicell Cell Culture InsertMillipore Sigma, Burlington, MA, USAPITP01250
Nexcelom cell counterNexcelom bioscience, Lawrence, MA, USACellometer Auto T4 Plus
PercollGE Healthcare, Chicago, IL, USA17-0891-01
Surgical scissorsF.S.T, Foster city, CA, USA14001-12
Very small curved dressing forcepsF.S.T, Foster city, CA, USA11063-07

Ссылки

  1. Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
  2. Ibrahim, S. H. Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).
  3. Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
  4. Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration. Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).
  5. Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).
  6. Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. Scavenger functions of the liver endothelial cell. Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).
  7. DeLeve, L. D. Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis. Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).
  8. Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
  9. Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis. Biology. 9 (11), Basel. 395(2020).
  10. Wu, L. Q., et al. Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).
  11. Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review. PLoS One. 11 (3), 0151945(2016).
  12. Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).
  13. Furuta, K., et al. Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis. Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).
  14. Guo, Q., et al. Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).
  15. Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 8 (7), 70599(2013).
  16. Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
  17. Olsavszky, V., et al. Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells. Gene. 768, 145284(2021).
  18. DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. Liver sinusoidal endothelial cell: An update. Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).
  19. DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).
  20. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
  21. Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649(2019).
  22. Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion. Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).
  23. Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).
  24. Liu, W., et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).
  25. Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).
  26. Schrage, A., et al. Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines. Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).
  27. Chou, C. H., et al. Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells. PLoS One. 10 (3), 0122060(2015).
  28. Deleve, L. D. Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).
  29. Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).
  30. Despoix, N., et al. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).
  31. Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver. Scientific Reports. 7, 44356(2017).
  32. Halpern, K. B., et al. Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

178LSECs

This article has been published

Video Coming Soon