Микроструктурный анализ для измерения хиральности клеток

Резюме

Представлен протокол определения многоклеточной хиральности in vitro с использованием методики микроструктурирования. Этот анализ позволяет автоматически количественно определять смещения влево-вправо различных типов клеток и может использоваться для целей скрининга.

Аннотация

Хиральность — это внутреннее клеточное свойство, которое изображает асимметрию с точки зрения поляризации вдоль лево-правой оси клетки. Поскольку это уникальное свойство привлекает все большее внимание из-за его важной роли как в развитии, так и в заболевании, стандартизированный метод количественной оценки для характеристики хиральности клеток будет способствовать исследованиям и потенциальным приложениям. В этом протоколе мы описываем многоклеточный анализ характеристик хиральности, который использует микроструктурированные массивы клеток. Сотовые микрошарики изготавливаются на стеклянных слайдах с титановым/золотым покрытием с помощью микроконтактной печати. После посева на геометрически определенных (например, кольцеобразных) островах, покрытых белком, клетки направленно мигрируют и образуют смещенное выравнивание в сторону либо по часовой стрелке, либо против часовой стрелки, которое может быть автоматически проанализировано и количественно определено с помощью специально написанной программы MATLAB. Здесь мы подробно описываем изготовление микроструктурированных субстратов, посев клеток, сбор изображений и анализ данных и показываем репрезентативные результаты, полученные с использованием клеток NIH/3T3. Этот протокол ранее был подтвержден в нескольких опубликованных исследованиях и является эффективным и надежным инструментом для изучения хиральности клеток in vitro.

Введение

Лево-правая (LR) асимметрия клетки, также известная как клеточная рука или хиральность, описывает полярность клетки в оси LR и признается фундаментальным, сохраненным, биофизическим свойством 1,2,3,4,5. Хиральность клеток наблюдалась как in vivo, так и in vitro в нескольких масштабах. Предыдущие результаты показали хиральное закручивание актинового цитоскелета в одиночных клетках, посеянных на круглых островах⁶, смещенную миграцию и выравнивание клеток в пределах ог....

протокол

1. Изготовление марок полидиметилсилоксана (PDMS)¹⁶

1. Нарисуйте массив микромасштабных колец с помощью программного обеспечения CAD с внутренним диаметром 250 мкм и внешним диаметром 450 мкм. Шаблон, используемый в этом протоколе, представляет собой массив 10 x 10 с расстоянием между кольцами 850 мкм.
2. Распечатайте маску прозрачности узора в нужном разрешении с помощью сервиса печати масок компании микрофабрикации (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Было доказано, что предоставленные размеры кольца работают для многих типов клеток⁷.
3. Проводят ультрафиолетовую (УФ) фотолитог....

Результаты

Через пятнадцать минут после посева клеток NIH/3T3 адгезия клеток на кольцевом рисунке была визуально подтверждена фазово-контрастной визуализацией. После последующей культивирования в течение 24 ч клетки на узорах становились сливающимися и вытянутыми с явно асимметричными выравниван?.......

Обсуждение

Кольцеобразный анализ паттернов, описанный здесь, обеспечивает простой в использовании инструмент для количественной характеристики многоклеточной хиральности, способный давать высоконадежные и повторяемые результаты. Быстрая генерация идентичных микросред и непредвзятый анализ .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 proof ethanol	Koptec	DSP-MD-43
BZX microscope system	Keyence	BZX-600
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Electron beam evaporator	Temscal	BJD-1800	Gold-titanum film coating
Fetal bovine serum	VWR	89510-186
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141-5MG
Glass microscope slides	VWR	10024-048
Glass tweezers	Exelta	390BSAPI
Gold evaporation pellets	International Advanced Materials	AU18
HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)	Prochimia	TH 001-m11.n3-0.2
MATLAB	Mathworks	MATLAB_R2020b
NIH/3T3 cells	ATCC	CRL-1658
OAI contact aligner	OAI	200	UV photolithography
Octadecanethiol (C18)	Sigma	O1858-25ML
Orbital shaker	VWR	89032-088
Phosphate buffered saline (PBS)	Research product international	P32080-100T
Polydimethylsiloxane Sylgard 184	Dow Corning	DC4019862
Silicon Wafer	University Wafer	ID#809
Sodium pyruvate	Thermo fisher scientific	11360-070
SU-8 3050 photoresist	MicroChem	Y311075 0500L1GL
Titanium evaporation pellets	International Advanced Materials	TI14
Transparency mask (with feature)	Outputicity.com	N/A	Mask printing service
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo fisher scientific	25200-072