JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Диабетическая ретинопатия является одной из ведущих причин слепоты. Гистология, анализ разрушения барьера сетчатки крови и флуоресцентная ангиография являются ценными методами для понимания патофизиологии сетчатки, что может еще больше повысить эффективность скрининга лекарств против диабетической ретинопатии.

Аннотация

Заболевание заднего сегмента глаз, такое как диабетическая ретинопатия, изменяет физиологию сетчатки. Диабетическая ретинопатия характеризуется отслоением сетчатки, нарушением гемато-ретинального барьера (BRB) и ангиогенезом сетчатки. Модель крысы in vivo является ценным экспериментальным инструментом для изучения изменений в структуре и функции сетчатки. Мы предлагаем три различных экспериментальных метода в модели крыс для выявления морфологических изменений клеток сетчатки, сосудистой системы сетчатки и скомпрометированного BRB. Гистология сетчатки используется для изучения морфологии различных клеток сетчатки. Кроме того, количественное измерение выполняется путем подсчета клеток сетчатки и измерения толщины различных слоев сетчатки. Анализ распада BRB используется для определения утечки экстраокулярных белков из плазмы в стекловидное тело из-за распада BRB. Флуоресцентная ангиография используется для изучения ангиогенеза и утечки кровеносных сосудов путем визуализации сосудистой системы сетчатки с использованием красителя FITC-декстран.

Введение

Диабетическая ретинопатия (ДР) является одним из самых сложных вторичных осложнений сахарного диабета. Это также является основной причиной предотвратимой слепоты среди населения трудоспособного возраста во всем мире. В недавнем мета-анализе 32,4 миллиона слепых людей 830 000 (2,6%) человек были слепыми из-за DR1. Доля потери зрения, связанной с диабетом, заняла седьмое место в 2015 году с 1,06% (0,15-2,38) во всем мире2,3.

Диабетическая ретинопатия диагностируется сосудистыми аномалиями в задних глазных тканях. Клинически он делится на две стадии – непролиферативный ДР (NPDR) и пролиферативный DR (PDR), основанный на васкуляризации в сетчатке. Гипергликемия считается мощным регулятором ДР, поскольку она включает в себя несколько путей, участвующих в нейродегенерации4,5, воспалении6,7 и микроциркуляторном русле8 в сетчатке. Множественные метаболические осложнения, вызванные гипергликемией, включают накопление конечных продуктов гликирования (AGE), полиольного пути, гексозаминового пути и пути протеинкиназы-С. Эти пути отвечают за пролиферацию клеток (эндотелиальные клетки), миграцию (перициты) и апоптоз (нервные клетки сетчатки, перициты и эндотелиальные клетки) на основе различных стадий диабетической ретинопатии. Эти метаболические изменения могут привести к физиологическим изменениям, таким как отслоение сетчатки, потеря клеток сетчатки, разрушение гематоэнцефалического барьера (BRB), аневризмы и ангиогенез9.

Стрептозотоцин (СТЗ), индуцированный диабетом 1 типа, является хорошо зарекомендовавшей себя и общепринятой практикой у крыс для оценки патогенеза диабета и его осложнений. Диабетогенные эффекты СТЗ обусловлены селективным разрушением островков поджелудочной железы β-клеток10. В результате животные будут подвергаться дефициту инсулина, гипергликемии, полидипсии и полиурии, все из которых характерны для сахарного диабета 1 типа 11. При тяжелой индукции диабета СТЗ вводят при 40-65 мг/кг массы тела внутривенно или внутрибрюшинно во взрослом возрасте. Примерно через 72 ч у этих животных уровень глюкозы в крови превышает 250 мг/дл10,12.

Чтобы понять физиологические изменения сетчатки из-за нейродегенерации, воспаления и ангиогенеза, различные методы должны быть оптимизированы на экспериментальных моделях животных. Структурные и функциональные изменения в клетках сетчатки и сосудах сетчатки могут быть изучены различными методами, такими как гистология, анализ распада BRB и флуоресцентная ангиография.

Гистология предполагает изучение анатомии клеток, тканей и органов на микроскопическом уровне. Устанавливает корреляцию между структурой и функцией клеток/тканей. Выполняется несколько этапов для визуализации и идентификации микроскопических изменений в структуре тканей, тем самым сравнивая здоровых и больных аналогов13. Следовательно, важно тщательно стандартизировать каждый шаг гистологии. Различные этапы, связанные с гистологией сетчатки, включают фиксацию образца, обрезку образца, обезвоживание, очистку, пропитку парафином, встраивание парафина, сечение и окрашивание (окрашивание гематоксилином и эозином)13,14.

В здоровой сетчатке транспорт молекул через сетчатку контролируется BRB, состоящим из эндотелиальных клеток и перицитов на внутренней стороне и пигментных эпителиальных клеток сетчатки на внешней стороне. Тем не менее, внутренние эндотелиальные клетки BRB и перициты начинают дегенерировать во время болезненного состояния, и BRB также скомпрометирован15. Из-за этого распада BRB многие низкомолекулярные молекулы просачиваются в стекловидное тело и ткань сетчатки16. По мере прогрессирования заболевания многие другие белковые молекулы (с низкой и высокой молекулярной массой) также просачиваются в стекловидное тело и ткань сетчатки из-за нарушения гомеостаза17. Это приводит к различным другим осложнениям и, в конечном счете, к макулярному отеку и слепоте. Следовательно, количественная оценка уровня белка в стекловидном теле и сравнение здоровых и диабетических состояний измеряет скомпрометированный BRB.

Флуоресцентная ангиография – это методика, используемая для изучения кровообращения сетчатки и сосудистой оболочки с использованием флуоресцентного красителя. Он используется для визуализации сосудистой системы сетчатки и сосудистой оболочки путем введения флуоресцеинового красителя внутривенным путем или сердечной инъекцией18. Как только краситель вводится, он сначала достигает артерий сетчатки, а затем вен сетчатки. Эта циркуляция красителя обычно завершается в течение 5-10 мин после инъекции красителя19. Это важный метод диагностики различных заболеваний заднего сегмента глаз, включая диабетическую ретинопатию и хориоидальную неоваскуляризацию20. Он помогает обнаружить большие и незначительные изменения сосудистой системы в нормальных и больных условиях.

протокол

Этот протокол следует всем руководящим принципам ухода за животными, предоставленным Институциональным комитетом по этике животных, BITS-Pilani, кампус Хайдарабада.

1. Гистология сетчатки

  1. Энуклеация и фиксация глаза
    1. Усыплите самца крысы Wistar в возрасте от 2 до 3 месяцев вместе с соответствующим возрасту контролем (от 14 до 15 недель), используя высокую дозу пентобарбитала (150 мг / кг), введенную через внутрибрюшинный путь. Отсутствие обнаруживаемого сердцебиения подтверждает смерть в течение 2-5 мин.
    2. Энуклеат глаза, делая разрезы с помощью лезвия скальпеля на носовой и височной областях глаза. Затем разрезайте по краям с помощью щипцов и микроножек, чтобы удалить глаз из орбитальной лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем жертвовать крысами, держите фиксирующие растворы наготове.
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид раздражает кожу, глаза, нос и дыхательные пути. Он также может вызвать рак, поскольку является мощным сенсибилизатором кожи. Наденьте перчатки и держите их под капотом21.
    3. Тщательно промойте глаза 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в чашке Петри для удаления крови. Удалите лишний жир, окружающий глаз, для легкого проникновения фиксирующего раствора.
    4. Сразу поместите глаз в 5 мл фиксирующего раствора с помощью щипцов, и убедитесь, что он не приклеен к стенкам стеклянных флаконов. Осторожно перемешайте в течение нескольких секунд и замените колпачок правильной маркировкой. Инкубировать глаз в фиксаторном растворе в течение 24 - 48 ч в темных условиях при комнатной температуре.
  2. Обрезка тканей
    1. После фиксации удалить глаз из фиксирующего раствора, промыть 10 мл PBS и поместить его в чашку Петри, содержащую 10 мл PBS, охлажденного при 4 °C.
    2. Используя микрощипцы, удерживайте глаз зрительным нервом и сделайте кольцу на pars plana с помощью микроножек. Прорежьте весь край роговицы, чтобы отделить переднюю чашечку глаза. Используя щипцы, аккуратно подберите хрусталик, выбросьте его и перережьте зрительный нерв.
    3. С помощью изогнутых микроножек сделайте продольный участок задней глазницы, пройдя через оптический диск, разделив его на две половины. Поместите его в основание кассеты и плотно закройте крышку должным образом без какого-либо нарушения ткани. Пометьте кассеты именем и датой образца ткани.
  3. Обезвоживание, очистка и парафиновая пропитка тканей
    1. Обезвоживают обрезанную ткань путем постепенного переноса в 80 мл 50%, 70%, 90% и 100% этанола. При переносе кассет из одной концентрации в другую обязательно нанесите их на чистую папиросную бумагу, чтобы свести к минимуму загрязнение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте салфетке постоять в каждом переносе в течение 30 минут (дважды). Общее время, затрачиваемое на этот этап, составляет примерно 4 часа.
    2. При обезвоживании переложите кассеты в 80 мл ксилола в течение 30 мин (дважды), чтобы заменить этанол ксилолом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации с ксилолом ткань становится полупрозрачной.
      ВНИМАНИЕ: Ксилол представляет собой ароматическое соединение с бензольным кольцом. Он раздражает глаза и слизистую оболочку, а также может вызывать депрессии.
    3. Наконец, пропитайте ткань предварительно нагретым парафином при 60 °C, чтобы заменить ксилол в ткани. Нанесите кассеты несколько раз на папиросную бумагу, чтобы свести к минимуму содержание ксилола, и поместите в 200 мл парафина (жидкости при 60 °C) в течение 2 ч (1 ч х 2).
      ВНИМАНИЕ: Избегайте вдыхания расплавленного парафина, так как он производит крошечные липидные капли, которые могут вызвать респираторный дискомфорт.
  4. Встраивание парафина
    1. Включите машину для встраивания парафина не менее чем за 1 ч до использования, чтобы расплавить парафин и чтобы станции достигли желаемых температур. Заполните стальную форму расплавленным парафиновым воском, поместив его на горячую поверхность, затем извлеките по одной кассете за раз из контейнера с парафином.
    2. Переместите стальную форму с горячей на холодную поверхность (4 °C). В этот момент воск в форме начнет затвердевать. Прежде чем он полностью затвердеет, поместите ткань в воск с помощью щипцов и сориентируйте ткань так, чтобы часть диска зрительного нерва задней чашки была обращена к основанию формы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ткань не двигается и сохраняет желаемую ориентацию. Если нет, поместите форму обратно на теплую рабочую поверхность до тех пор, пока весь парафин не разжижится, затем начните снова с шага 1.4.2.
    3. Как только воск в форме начнет затвердевать, немедленно поместите основание кассеты поверх формы. Аккуратно заполните форму парафином над верхним краем кассеты и медленно перенесите ее на холодную поверхность (около -20 °C) для быстрого затвердевания. Пока он не затвердеет, повторите процесс с другими кассетами из шага 1.4.2.
    4. Как только все формы затвердеют, отделите стальную форму от кассеты. Если это трудно, подождите немного дольше и повторите попытку (не удаляйте его с силой). Сепарация становится легче после полного затвердевания. Теперь кассета становится основанием парафинового блока, который будет удерживаться во время секционирования микротомом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот блок можно хранить при комнатной температуре для дальнейшего использования. На этом этапе процесс может быть остановлен и продолжен позже (при необходимости).
  5. Секционирование
    1. Установите одноразовое микротомовое лезвие в держатель лезвия. Удалите лишний парафиновый воск вокруг кассет, чтобы верхняя и нижняя части блоков оставались параллельны ножу. Установите блок на держатель кассеты.
    2. Разблокируйте ручное колесо, чтобы продвинуть его до тех пор, пока поверхность блока не соприкоснется с лезвием ножа. Обрежьте избыток парафинового воска на блоке до тех пор, пока ткань не будет визуализирована на поверхности блока. Установите толщину сечения на 5 мкм и перережьте ленту из пяти-шести секций.
    3. С помощью щипцов аккуратно перенесите ленту на поверхность предварительно нагретой водяной бани (около 50 °C), чтобы развернуть ленту. Соберите секции на стеклянной горке, покрытой альбумином Майера, удерживая слайд под секцией. Осторожно поднимите секции и дайте горкам высохнуть горизонтально в течение ночи при температуре 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды можно хранить при комнатной температуре в сухих ящиках в течение нескольких месяцев. На этом этапе процесс может быть остановлен и продолжен позже.
  6. Окрашивание
    1. Нагрейте предметные стекла для окрашивания в горячей воздушной печи при 60 °C в течение 1 часа перед использованием, чтобы парафин расплавился, и выполните действия, указанные в таблице 1.
      ВНИМАНИЕ: Пятна гематоксилина и эозина токсичны при вдыхании или приеме внутрь. Сообщалось, что они являются канцерогенными.
РеагентСтоячее времяПовторение (количество раз)
Ксилол5 мин2
100% этанол5 мин2
90% этанол5 мин2
70% этанола5 мин2
50% этанол5 мин2
Вода5 мин2
Гематоксилин4 мин1
Промывка водой
1% кислый спирт в 70% этаноле30 с1
Промывка водой
Вода Скотта1 мин1
Промывка водой
50% этанол1 мин1
95% этанол1 мин1
0,25% Эозин5 с1
Промывка водой
Вода2 мин1
95% этанол1 мин1
100% этанол1 мин1
Ксилол5 мин2
Крепление и крышка

Таблица 1. Процедура окрашивания гематоксилина и эозина

2. Анализ разрушения гематоэнцефалического барьера

  1. Забор крови и стекловидного тела
    1. Обезболить самца крысы Wistar в возрасте от 2 до 3 месяцев вместе с соответствующим возрасту контролем (от 14 до 15 недель) с использованием кетамина (80 мг / кг) и ксилазина (8 мг / кг). Подтвердите состояние анестетика с помощью рефлекса снятия педали (защемление пальца ноги). Немедленно соберите 1 мл крови путем пункции сердца в трубку, покрытую этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА), чтобы отделить плазму от цельной крови.
    2. Усыпляют крысу, используя высокую дозу пентобарбитала (150 мг/кг), вводимую через внутрибрюшинный путь. Отсутствие обнаруживаемого сердцебиения подтверждает смерть в течение 2-5 мин. Энуклеарьте глаз и сразу же поместите его на сухой лед.
    3. Поместите глаз в чистую чашку Петри над сухим льдом (рекомендуется) и начните рассекать глаз, как указано в шаге 1.2.2.
    4. Снимите хрусталик, осторожно вытяните стекловидное тело из задней чашки с помощью микрощипцов и поместите его в гомогенизационную трубку, содержащую три-четыре стеклянных шарика (2-4 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение на сухом льду рекомендуется, так как удаление хрусталика и стекловидного тела легче в условиях замерзания.
  2. Подготовка образцов
    1. Гомогенизировать стекловидное тело в гомогенизаторе бисера на средней скорости в течение 10 с.
    2. Перенесите образцы крови (1 мл) и стекловидного тела (10-20 мкл) в микроцентрифужные пробирки и центрифугируйте оба образца при 5200 х г в течение 10 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае успешной гомогенизации стекловидное тело имеет равномерную консистенцию после центрифугирования. Однако в случае неравномерной консистенции стекловидного тела повторить с этапа 2.2.1 с увеличенным временем гомогенизации.
    3. Соберите супернатант из обоих образцов и разбавьте стекловидное тело и образцы плазмы в соотношении 1:10 и 1:20 соответственно с помощью PBS.
  3. Количественная оценка белка и соотношение белка стекловидного тела и плазмы
    1. Чтобы количественно оценить концентрацию белка в образцах стекловидного тела и плазмы, добавьте 5 мкл разбавленных образцов к 250 мкл реагента Брэдфорда, хорошо перемешайте и прочитайте абсорбцию при 590 нм в течение 40 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если величина абсорбции образцов превышает 1,0, дополнительно разбавьте образцы и повторите процедуру, описанную на этапе 2.2.3.
    2. Нормализуйте уровень белка стекловидного тела до уровня белка плазмы у той же крысы и измерьте разницу в складках между здоровыми и диабетическими крысами.

3. Флуоресцентная ангиография

  1. FITC-декстран70000 краситель для инъекций
    1. Обезболить самца крысы Wistar в возрасте от 2 до 3 месяцев вместе с соответствующим возрасту контролем (от 14 до 15 недель) с использованием 3% изофлурана и подтвердить рефлекс снятия педали (защемление пальца ноги). Окуните хвост в стакан, содержащий теплую воду (37-40 °C). Очистите хвост 70% этанолом перед инъекцией красителя. Найдите боковую вену хвоста и отметьте положение инъекции в нижней части хвоста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если введение иглы не удается, попробуйте вставить в другое место выше текущего положения (кончик к основанию хвоста). Тем не менее, рекомендуется вводить один раз, так как повторное покалывание может привести к развитию стресса у крысы, что может вызвать сужение сосудов.
    2. Вводят 1 мл 50 мг/мл раствора красителя FITC-dextran70000 через хвостовую вену и дают красителю циркулировать в течение 5 мин. Усыпляют крысу высокой дозой пентобарбитала (150 мг/кг), вводимой внутрибрюшинным путем. Отсутствие обнаруживаемого сердцебиения подтверждает смерть в течение 2-5 мин. Энуклеат глаза, как указано в шаге 1.1.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости глаз можно зафиксировать в 4% растворе формальдегида, не более чем на 30 мин.
  2. Подготовка плоского крепления
    1. Для подготовки плоских креплений держите инструменты для рассечения наготове вместе с направляющими и крышками. Поместите глаз в чашку Петри, наполненную охлажденным PBS, и начните рассекать глаз, как описано в шаге 1.2.2.
    2. Теперь поместите кончик заостренного щипца между склерой и сетчаткой. Осторожно переместите его по всему краю чашки, убедившись, что сетчатка не прикреплена к склере в любой точке. Если есть какие-либо препятствия, медленно отрежьте эту часть вдоль обода с помощью изогнутых микроножек.
    3. Как только подтвердится, что сетчатка не прикреплена к склере с какой-либо стороны, разрезают возле диска зрительного нерва, сделав небольшое отверстие таким, что сетчатка полностью отделяется от склеры. Медленно протолкните сетчатку в раствор PBS и поместите ее на чистый плоский слайд с помощью шпателя или щипцов.
    4. С помощью микроножек или лезвий скальпеля сделайте незначительные надрезы в ткани сетчатки, разделив ее на четыре квадранта. Убедитесь, что разрезы находятся на расстоянии не менее 2 мм от отверстия, оставленного оптическим диском в центре, как показано на рисунке 1.
    5. Удалите излишки PBS с боков ткани с помощью наконечников 0,2 мл, не нарушая плоское крепление.
    6. Поместите каплю антивядающей монтажной среды (от 50 мкл до 100 мкл) на плоское крепление, накройте крышкой и визуализируйте сразу под конфокальным микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте минимальный свет в течение всей процедуры.
  3. Визуализация плоского крепления
    1. Визуализируйте плоское крепление под 10-кратным объективом конфокального микроскопа. Выполните сканирование плиток, чтобы захватить все плоское крепление в виде одного образа. Количество плиток зависит от размера плоского крепления сетчатки. Также выполняют Z-укладку для визуализации вен и артерий в разных очагах (предпочтительный размер для Z-стека составляет 5 мкм, в зависимости от которого, количество шагов Z-стека варьируется).
    2. Используйте детекторы PMT и HyD при % выигрыша в 700-900 и 100-150 соответственно. Выберите диапазон излучения от 510 до 530 нм для красителя FITC-dextran.

Результаты

Гистология сетчатки
В диабетической сетчатке клетки сетчатки подвергаются дегенерации. Кроме того, толщина слоев сетчатки увеличивается из-за отеков22. Изображения, полученные после окрашивания гематоксилином и эозином, могут быть использованы для подсчета кл?...

Обсуждение

Гистология
Гистология сетчатки проводится для визуализации морфологических изменений клеток и слоев сетчатки. Необходимо оптимизировать различные этапы, включая выбор фиксирующего раствора, продолжительность фиксации, обезвоживание и пропитку парафином. Размер ткани не ...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить Индийский совет медицинских исследований (ICMR; ITR-2020-2882) для финансирования поддержки д-ра Нирмала Дж. Мы также хотели бы поблагодарить Университетский грант Комиссии за предоставление младшей исследовательской стипендии Манише Малани и Центральному аналитическому лабораторному центру, BITS-Pilani, кампус Хайдарабада для предоставления инфраструктурного объекта.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Histology
Reagents
IsofluraneAbbottAnesthesia agent
Ketamine hydrochlorideTroikaa PharmaceuticalsAnesthesia agent
XylazineIndian Immunologicals LimitedAnesthesia agent
Pentobarbital sodiumZora PharmaEuthanesia agent
Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % GlutaraldehydeHiMedia, AvraMB059, ASG2529Prepared in-house
EthanolHaymanF204325Dehydration
XyleneHiMediaMB-180Clearing of ethanol or paraffin
Paraffin waxHiMediaGRM10702used for embedding tissue
GlycerolHiMediaTC503To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides
Hydrochloric acidSisco Research laboratories Pvt. Ltd.65955For preparation of 1 % acid alcohol
Acetic acidHiMediaAS119For preparation of eosin
Scotts waterLeica3802900Bluing reagent
Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solutionSigma1.09254.0500Staining of nuclei
EosinHiMediaGRM115Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house
DPX Mountant mediaSigma6522Visualization and protection of retinal sections
Equipments
GlasswareBorosil
Corneal forcepStephens InstrumentsS5-1200Dissection
Colibri forcepStephens InstrumentsS5-1135Dissection
Curved micro scissorStephens InstrumentsS7-1311Dissection
Vannas scissorStephens InstrumentsS7-1387Dissection
Iris scissorStephens InstrumentsS7-1015Dissection
CassettesHiMediaPW1292To hold tissue during histology processing
Water bathGT SonicGT Sonic-D9Temperature maintenance
Paraffin embedding stationMyrEC 350Preparation of paraffin blocks
MicrotomeZhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.YD-335ASectioning
BladesLeicaLeica 818Sectioning
SlidesHiMediaBG005Holding paraffin-tissue sections
CoverslipsHiMediaBG014CTo cover tissue after adding mounting media
Blood Retinal Barrier breakdown
Reagents
IsofluraneAbbottB506Anesthesia
Dry iceNot applicableNot applicableDissection
Bradford reagentSigmaB6916Protein quantification
Equipments
Corneal forcepStephens InstrumentsS5-1200Dissection
Colibri forcepStephens InstrumentsS5-1135Dissection
Curved micro scissorStephens InstrumentsS7-1311Dissection
Vannas scissorStephens InstrumentsS7-1387Dissection
Iris scissorStephens InstrumentsS7-1015Dissection
GlasswareBorosilNot applicable
EDTA coated tubesJ.K DiagnosticsNot applicableSeparate plasma from whole blood
Homogenization tubesMP BiomedicalsSKU: 115076200-CFHomogenization of vitreous
Homogenization capsMP BiomedicalsSKU: 115063002-CFHomogenization of vitreous
Glass beadsMP BiomedicalsSKU: 116914801Homogenization of vitreous
HomogeniserBertin InstrumentsP000673-MLYS0-AHomogenization of vitreous
96-well plate - TransparentGrenierGN655101Protein quantification
Plate readerMolecular devicesSpectrMax M4Absorbance measurement
CentrifugeREMICPR240 PlusCentrifugation
Fluorescence Angiography
Reagents
IsofluraneAbbottB506Anesthesia
FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSOFITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMediaFITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185Prepared in-house
FluoroshiedSigmaF6182Anti-fading mounting medium
Equipments
Corneal forcepStephens InstrumentsS5-1200Dissection
Colibri forcepStephens InstrumentsS5-1135Dissection
Curved micro scissorStephens InstrumentsS7-1311Dissection
Vannas scissorStephens InstrumentsS7-1387Dissection
Iris scissorStephens InstrumentsS7-1015Dissection
GlasswareBorosilNot applicable
SlidesHiMediaBG005Flatmount preparation
CoverslipsHiMediaBG014CTo cover tissue after adding mounting media
Confocal microscopeLeicaDMi8Visualization of flatmount

Ссылки

  1. Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
  2. Pandova, M. G. . Visual Impairment and Blindness. , (2019).
  3. Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, 159-172 (2019).
  4. Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
  5. El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
  6. Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
  7. Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
  8. Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
  9. Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
  11. Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
  12. Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
  13. Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).
  14. Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
  15. Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
  16. do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
  17. Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
  18. D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
  19. Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
  20. Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
  21. Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
  22. Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
  23. Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
  24. Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).
  25. Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
  26. D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
  27. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены