JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол описывает получение колонок клеточной мембранно-аффинной хроматографии (CMAC) с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны, содержащими функциональные трансмембранные тропомиозинкиназные рецепторы В-белки. Также объясняется использование колонок CMAC для идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с этими рецепторами и присутствующих в сложных природных смесях.

Аннотация

Химические вещества, синтезируемые растениями, грибами, бактериями и морскими беспозвоночными, были богатым источником новых лекарственных средств и свинец. Лекарства, такие как статины, пенициллин, паклитаксел, рапамицин или артемизинин, обычно используемые в медицинской практике, были впервые идентифицированы и выделены из натуральных продуктов. Однако идентификация и выделение биологически активных специализированных метаболитов из природных источников является сложным и трудоемким процессом. Традиционно отдельные метаболиты выделяют и очищают от сложных смесей после экстракции биомассы. Впоследствии выделенные молекулы тестируются в функциональных анализах для проверки их биологической активности. Здесь мы представляем использование колонок клеточной мембранной аффинной хроматографии (CMAC) для идентификации биологически активных соединений непосредственно из сложных смесей. Колонки CMAC позволяют идентифицировать соединения, взаимодействующие с иммобилизованными функциональными трансмембранными белками (TMP), встроенными в их нативную фосфолипидную двухслойную среду. Это целенаправленный подход, который требует знания TMP, активность которого предполагается модулировать с недавно идентифицированным кандидатом на низкомолекулярное лекарство. В этом протоколе мы представляем подход к подготовке колонок CMAC с иммобилизованным тропомиозинкиназным рецептором B (TrkB), который стал жизнеспособной мишенью для открытия лекарств для многочисленных расстройств нервной системы. В этой статье мы предоставляем подробный протокол для сборки колонки CMAC с иммобилизованными рецепторами TrkB с использованием клеточных линий нейробластомы, чрезмерно экспрессирующих рецепторы TrkB. Далее представлен подход к исследованию функциональности колонки и ее использование при идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с рецепторами TrkB.

Введение

Ботанические смеси богаты фармакологически активными соединениями1, служащими хорошим источником для идентификации новых лекарственных хитов и свинец 2,3,4,5. Открытие новых лекарств из натуральных продуктов было плодотворным подходом, и многие одобренные в настоящее время лекарства произошли из соединений, впервые идентифицированных в природе. Химическое разнообразие природных соединений трудно сопоставить с искусственными библиотеками химически синтезированных молекул. Многие природные соединения взаимодействуют и модулируют мишени человеческого белка и могут считаться эволюционно оптимизированными лекарственными молекулами6. Эти природные соединения особенно хорошо подходят для идентификации лекарственного свинца для использования при неврологических расстройствах6. Два из одобренных в настоящее время FDA препаратов для лечения болезни Альцгеймера (БА) получены из природных алкалоидов, а именно: галантамин и ривастигмин (производное физостигмина)6. L-DOPA, в настоящее время наиболее часто назначаемый препарат при болезни Паркинсона, был впервые идентифицирован из широкой фасоли (Vicia faba L.) 7. Перголид и лизурид, агонисты дофаминергических рецепторов являются производными природных алкалоидов спорыньи из паразитического гриба Claviceps purpurea8. Резерпин, алкалоид, выделенный из индийского змеиного корня (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz), был одним из первых антипсихотических препаратов9. В последнее время дисрегулируемый иммунный ответ и системное воспаление были связаны с развитием многочисленных неврологических заболеваний, таких как большое депрессивное расстройство или нейродегенеративные заболевания10. Было обнаружено, что растительная диета вместе с другими вмешательствами в образ жизни улучшает когнитивные и функциональные способности у пожилых людей 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Было обнаружено, что некоторые электрофильные молекулы, принадлежащие тритерпенам и полифенолам, модулируют воспалительные реакции как в моделях in vitro, так и in vivo 12. Например, природные соединения, содержащие α β-ненасыщенного карбона (например, куркумин, циннамальдегид) или изотиоцианатную группу (например, сульфорафан), препятствуют димеризации Toll-подобного рецептора-4 (TLR4), ингибируя последующий синтез провоспалительных цитокинов в мышиной интерлейкин-3-зависимой про-В клеточной линии12,22 . Эпидемиологические данные убедительно указывают на то, что диетические фитохимические вещества, присутствующие в сложных пищевых матрицах, также могут представлять собой жизнеспособный источник новых лекарственных проводов6.

Одним из основных препятствий в идентификации биологически активных молекул, присутствующих в растительных экстрактах, включая растительную пищу, является сложность исследуемых образцов. Традиционно отдельные соединения выделяют, очищают и впоследствии проверяют на биологическую активность. Такой подход обычно приводит к выявлению наиболее распространенных и хорошо охарактеризованных соединений. Подходы к открытию фенотипических лекарств без определенной молекулярной мишени основаны на био-управляемом фракционировании сложных смесей23. При таком подходе экстракт фракционируется на менее сложные субфракции, которые впоследствии тестируются в фенотипических анализах. Выделение и очистка активных соединений определяются биологической активностью, проверенной в анализе. Знание идентичности указанной лекарственной мишени может значительно ускорить идентификацию фармакологически активных соединений, присутствующих в сложных смесях. Эти подходы обычно основаны на иммобилизации молекулярной мишени, например, фермента, на твердой поверхности, такой как магнитные шарики23. Иммобилизованные мишени впоследствии используются в скрининговых экспериментах, что приводит к выделению соединений, взаимодействующих с мишенью. Хотя этот подход широко использовался при идентификации соединений, нацеленных на цитозольные белки, он реже применялся при идентификации химических веществ, взаимодействующих с трансмембранными белками (TMP)23. Дополнительная проблема в иммобилизации TMP связана с тем, что активность белка зависит от его взаимодействия с фосфолипидами клеточной мембраны и другими молекулами в бислое, такими как холестерин23,24. Важно сохранить эти тонкие взаимодействия между белками и их нативной фосфолипидной двухслойной средой при попытке обездвижить трансмембранную мишень.

При сродстве клеточной мембраны (CMAC) фрагменты клеточной мембраны, а не очищенные белки, иммобилизуются на искусственной мембране (IAM) частиц стационарной фазы23. Стационарные фазы IAM получают путем ковалентного связывания аналогов фосфатидилхолина с кремнеземом. В последнее время были разработаны новые классы стационарных фаз IAM, в которых свободные аминные и силаноловые группы являются концевыми (IAM. ПК. Частицы DD2). При подготовке колонок CMAC фрагменты клеточной мембраны иммобилизуются на поверхность частиц IAM путем адсорбции.

Колонки CMAC до настоящего времени использовались для иммобилизации различных классов TMP, включая ионные каналы (например, никотиновые рецепторы), GPCR (например, опиоидные рецепторы), переносчики белка (например, p-гликопротеин) и т.д.24. Иммобилизованные белковые мишени были использованы для характеристики фармакодинамики (например, константа диссоциации, Kd) или определения кинетики связывания (kon и koff) лигандов малых молекул, взаимодействующих с мишенью, а также в процессе идентификации потенциальных новых лекарственных проводов, присутствующих в комплексных матрицах24 . Здесь мы представляем подготовку колонок CMAC с иммобилизованным тропомиозинкиназным рецептором B (TrkB), который стал жизнеспособной мишенью для открытия лекарств для многочисленных расстройств нервной системы.

Предыдущие исследования показали, что активация нейротрофического фактора мозга (BDNF) / пути TrkB связана с улучшением некоторых неврологических заболеваний, таких как AD или большое депрессивное расстройство 25,26,27,28. Сообщалось, что уровни BDNF и экспрессия TrkB рецептора TrkB снижаются при AD, и аналогичные снижения ухудшают функцию гиппокампа на животных моделях AD29. Снижение уровня BDNF было зарегистрировано в сыворотке крови и головном мозге пациентов с БА 30,31,32. Было обнаружено, что сверхэкспрессия тау или гиперфосфорилирование снижают экспрессию BDNF в первичных нейронах и животных моделях AD 33,34,35. Кроме того, сообщалось, что BDNF оказывает защитное воздействие на нейротоксичность in vitro и in vivo36, индуцированную β-амилоидом. Было показано, что прямое введение BDNF в мозг крысы улучшает обучение и память у животных с когнитивными нарушениями37. BDNF / TrkB стал действительной мишенью для улучшения неврологических и психических расстройств, включаяAD 28,38. Нацеливание на сигнальный путь BDNF / TrkB для разработки методов лечения при БА потенциально улучшит наше понимание заболевания39. К сожалению, сам BDNF не может быть использован в качестве лечения из-за его плохих фармакокинетических свойств и неблагоприятных побочных эффектов40. Низкомолекулярные активаторы путей TrkB/BDNF были исследованы в качестве потенциальных лигандов TrkB 41,42,43. Среди протестированных агонистов малых молекул было показано, что 7,8-дигидроксифлавон (7,8-DHF) активирует путь BDNF / TrkB 41,44,45,46. Производное 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-фенил-4H-хромен-7,8-диил-бис(метилкарбамат)) в настоящее время рассматривается в качестве возможного лекарственного средства для AD47. Недавно было показано, что несколько антидепрессантов работают через прямое связывание с TrkB и содействие передаче сигналов BDNF, что еще больше подчеркивает важность использования TrkB в качестве действительной цели для лечения различных неврологических расстройств48.

Протокол описывает процесс сборки функциональной колонки TrkB и отрицательной управляющей колонки TrkB-NULL. Колонки характеризуются использованием известного натурального продукта мелкомолекулярного лиганда: 7,8-DHF. Дополнительно описан процесс скрининга сложных матриц, используя в качестве примера растительный экстракт, для идентификации соединений, взаимодействующих с TrkB.

протокол

1. Клеточная культура клеток нейробластомы SH-SY5Y (клеточные линии TrkB и TrkB-NULL (родительские))

ПРИМЕЧАНИЕ: Сотовые линии (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) и SH-SY5Y Родительская клеточная линия (TrkB NULL))49,50 были приобретены у Kerafast. Культивируемые клетки используются в качестве источника трансмембранных рецепторов, подлежащих иммобилизации для подготовки колонок CMAC. Следующие шаги описывают, как получить фрагменты клеточной мембраны и собрать функциональные колонны CMAC.

  1. Выращивайте клетки в клеточной культуральной среде, приготовленной путем смешивания 450 мл среды RPMI, 50 мл FBS, 5 мл раствора пенициллина / стрептомицина и 0,3 мг / мл генетикина (G418) в чашке для культивирования клеток 150 мм при 37 ° C во влажной атмосфере с 5% CO2.

2. Сбор клеток

  1. Подтвердить слияние клеток (80%-90%) с помощью микроскопа, достигнутое через 3-4 дня после прохождения клеток.
  2. Аспирировать клеточную культуральную среду сверху клеток и дважды промыть клетки фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS, 1x, pH 7,4). Удалите PBS и добавьте 2 мл низкоконцентрированного трипсина (0,25%) для отделения клеток.
  3. Осторожно закрутите пластину, чтобы равномерно покрыть все клетки раствором трипсина и инкубируйте клетки в течение примерно 2 мин при 37 °C во влажной атмосфере с 5% CO2. Добавьте 8 мл клеточной культуральной среды к отсоединяющимся клеткам и перенесите отсоединенные клетки в коническую трубку объемом 50 мл и поместите ее на лед.
  4. Используйте гемоцитометр для оценки количества клеток (примерно 3 х 107 клеток). Смешайте клеточную суспензию путем пипетки вверх и вниз, чтобы получить ровную плотность клеток в смеси. Поместите 10 мкл клеточной суспензии под крышку и подсчитайте клетки под микроскопом с помощью объектива 40x.

3. Гомогенизация клеток

  1. Готовят исходные растворы следующих ингибиторов протеазы: бензамидин (200 мМ), фенилметилсульфонилфторид (PMSF, 10 мМ) и коммерчески доступный коктейль ингибиторов протеазы (100-кратная концентрация), содержащий 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфторид гидрохлорид (AEBSF), апротинин, бестатин и леупептин.
    ВНИМАНИЕ: PMSF следует обрабатывать только внутри вытяжного шкафа.
    1. Готовят исходный раствор бензамидина (200 мМ), растворяя 120 мг бензамидина в 5 мл сверхчистой деионизированной воды. Хранить при температуре 4 °C и использовать в течение дня. Свежеприготовьте раствор перед каждым использованием (рекомендуется).
    2. Готовят готовый раствор PMSF (10 мМ), растворив 0,017 г PMSF в 10 мл этанола. Хранить при - 20 °C.
    3. Приготовьте коктейль ингибитора протеазы (100x), растворив коммерчески доступную смесь ингибиторов протеазы в 1 мл сверхчистой деионизированной воды. Тщательно перемешать и аликвотировать 200-300 мкл коктейля и хранить при - 20 °C перед употреблением.
  2. Приготовьте раствор АТФ (100 мМ), растворив 55,114 мг гидрата динатриевой соли АТФ в 1 мл деионизированной сверхчистой воды. Тщательно перемешайте и аликвот 100 мкл смеси и храните при - 20 °C перед использованием.
  3. Готовят буфер путем растворения 3,03 г трис(гидроксиметил)аминометана гидрохлорида (Tris-HCl, 50 мМ), 2,9 г хлорида натрия (NaCl, 100 мМ), 0,22 г хлорида кальция безводного (CaCl2, 3 мМ), 0,2 г гексагидрата хлорида магния (MgCl2, 2 мМ) и 0,19 хлористого калия (KCl, 5 мМ) в 500 мл сверхчистой деионизированной воды.
  4. Готовят буфер гомогенизации путем смешивания 17,3 мл буфера, приготовленного на стадии 3,3, с 0,3 мл (3 мМ) раствора бензамидина, 0,2 мл (0,1 мМ) раствора PMSF, 0,2 мл коктейльной смеси ингибитора протеазы, 20 мкл (100 мкм) раствора АТФ, 2 мл (10%) глицерина и 0,029 г (5 мМ) ЭДТА (таблица 1). Отрегулируйте рН до 7,4 с помощью раствора соляной кислоты.
  5. Открутите клетки, собранные на стадии 2.3 при 4 °C в течение 5 мин при 400 х г. Удалите супернатант и промыть оставшуюся ячейку гранулы 10 мл ледяного PBS (1x, pH 7,4). Снова раскрутите клетки при 4 °C в течение 5 мин при 400 х г.
  6. Выбросьте супернатант и замените его 20 мл буфера гомогенизации, приготовленного на этапе 3.4. Поместите коническую трубку на лед.
  7. Переложите клеточную суспензию в 40 мл гомогенизатора ткани Dounce и поместите ее на лед. Гомогенизируйте суспензию вручную, на льду, используя 40 ударов пестика вверх и вниз. Перенесите гомогенизированную клеточную суспензию в коническую трубку объемом 50 мл.
  8. Центрифугировать гомогенат при 4 °C в течение 7 мин при 400 х г. Выбросьте гранулу и переложите супернатант в новую коническую трубку и центрифугируйте его при 4 °C в течение 30 мин при 47900 х г. Сохраните гранулу клеточной мембраны и выбросьте супернатант.

4. Солюбилизация клеточных мембран

  1. Готовят солюбилизационный буфер путем смешивания 8,7 мл буферного раствора, изготовленного на стадии 3,3, с 0,1 мл (0,1 мМ) раствора PMSF, 0,15 мл (3 мМ) раствора бензамидина, 0,1 мл коктейля ингибитора протеазы, 10 мкл (100 мкм) раствора АТФ, 1 мл (10%) глицерина и 0,2 г (2%) холата натрия (таблица 2).
  2. Переложите буфер солюбилизации в коническую трубку с фрагментами клеточной мембраны, полученными на стадии 3.8, и повторно суспендируйте гранулу. Вращайте полученную смесь со скоростью 150 об/мин при 4 °C в течение 18 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эксперимент может быть приостановлен для ночной солюбилизации гранул клеточной мембраны.

5. Иммобилизация клеточных мембран на IAM. ПК. Частицы DD2

  1. Через 18 ч центрифугируют солюбилизационную смесь при 4 °C в течение 30 мин при 47900 х г.
  2. Сохраните супернатант и выбросьте гранулу. Добавьте 100 мг IAM. ПК. Частицы DD2 к надосадочному веществу вихряют и вращают полученную суспензионную смесь со скоростью 150 об/мин при 4 °C в течение 1 ч.
  3. Для облегчения иммобилизации фрагментов клеточных мембран на ИАМ. ПК. Частицы DD2 переходят на стадию диализа, как описано ниже.
    1. Готовят диализный буфер в 4 л сверхчистой деионизированной воды, добавляя 24 г трис-HCl (50 мМ), 23,4 г NaCl (100 мМ), 0,06 г CaCl2 (0,1 мМ), 5,85 г ЭДТА (5 мМ) и 0,07 г ПМСФ (0,1 мМ; Таблица 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: PMSF не растворяется в воде, поэтому растворяют его сначала в небольшом объеме этанола, а затем медленно добавляют в стакан с буфером.
    2. Отрегулируйте рН до 7,4 раствором соляной кислоты. Поместите буфер при температуре 4 °C не менее чем на 1 ч, прежде чем приступить к этапу диализа.
    3. Подготовьте диализную трубку, разрезав 10 см диализной трубки целлюлозной мембраны (10 K MWCO, 35 мм) и перенесите суспензию, содержащую IAM. ПК. Частицы DD2 и фрагменты клеточной мембраны попадают в диализную трубку. Используйте зажимы для диализных трубок, чтобы закрыть оба конца диализной трубки.
    4. Поместите диализную трубку, содержащую IAM. ПК. DD2 стационарная фаза в диализном буфере и диализ при 4 °C в течение 24 ч при осторожном перемешивании.
    5. Через 24 ч поместите диализную трубку в свежеприготовленный диализный буфер и продолжайте диализ еще 24 ч.

6. Упаковка колонн CMAC

  1. Подготовьте буфер ацетата аммония (10 мМ, рН 7,4), который будет использоваться для промывки IAM. ПК. Частицы DD2 и эксперименты по характеристике колонн путем растворения 0,7708 г ацетата аммония в 1 л сверхчистой деионизированной воды. Отрегулируйте рН до 7,4 раствором соляной кислоты.
  2. После 48 ч диализа удалите диализную трубку из диализного буфера и перенесите содержимое диализной трубки в коническую трубку объемом 15 мл.
  3. Центрифугировать смесь при 4 °С в течение 5 мин при 400 х г. Откажитесь от супернатанта и промывайте оставшуюся гранулу три раза 10 мл буфера ацетата аммония, центрифугируя смесь при 4 °C в течение 5 мин при 400 х г, после каждой промывки.
  4. После третьей промывки повторно суспендируют оставшуюся гранулу в 1 мл буфера ацетата аммония. Тщательно перемешайте его и используйте полученную суспензию, чтобы упаковать стеклянную колонку 5/20, чтобы получить колонку хроматографии CMAC.
  5. Чтобы упаковать колонну, сначала поместите нижний фильтр, предварительно пропитанный буфером ацетата аммония, в фильтродержатель. Установите фильтродержатель в стеклянную колонну и прикрутите колпачок колонны, чтобы закрепить положение держателя. Поместите колонну вертикально в зажим для пальцев и закрепите ее на лабораторной подставке. Поместите стакан под колонку.
  6. С помощью одноканального пипетчера перенесите небольшой объем суспензии, полученной на стадии 6.4, в стеклянную колонну. Налейте материал медленно, прижимая кончик пипетки к стеклянной стенке колонны. Дайте упаковочному материалу осесть, прежде чем заливать еще один объем навозной жижи.
  7. Чтобы ускорить процесс упаковки, снимите буфер над стационарным слоем с помощью микропипетки между каждым шагом. Повторяйте эти шаги до тех пор, пока не будет упакован 1 мл навозной жижи.
  8. Поместите верхний фильтр и прикрутите адаптер так, чтобы над неподвижной фазой не оставалось буфера, как показано на рисунке 1. Закрепите положение адаптера с помощью замка адаптера.
  9. Подключите колонку к высокопроизводительному насосу жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), установите расход на 0,2 мл/мин и промывайте колонну на ночь буфером ацетата аммония. Теперь столбец готов к этапу определения характеристик. Храните колонку при температуре 4 °C до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для более длительного хранения (колонка не используется дольше недели) проводят колонку с 0,05% раствором азида натрия в буфере ацетата аммония и хранят при 4 °C.
    ВНИМАНИЕ: Азид натрия очень токсичен при пероральном приеме внутрь или всасывается через кожу; его следует обрабатывать только под вытяжным кожухом. Обязательно наденьте лабораторный халат, защитные очки и перчатки (предпочтительно нитрил) при работе с азидом натрия.

7. Характеристика столбцов CMAC

  1. Конфокальная микроскопия и связывание BDNF
    1. Подготовьте IAM. ПКЦ. Частицы стационарной фазы DD2 с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны, полученные отдельно от клеток нейробластомы SH-SY5Y, чрезмерно экспрессирующих клетки TrkB и SH-SY5Y TrkB-NULL, следуя инструкциям от шага 1 до шага 6.4.
    2. Для образцов, которые будут инкубированы с BDNF до окрашивания антителами, приготовьте раствор BDNF путем растворения 10 мкг BDNF в 100 мкл сверхчистой деионизированной воды. Хранить раствор при температуре -20 °C.
      1. Перенос в отдельные 1,5 мл микроцентрифужных пробирок, 100 мкл аликвоты ИАМ. ПК. Упаковочный материал колонны DD2 с иммобилизованными клетками нейробластомы SH-SY5Y, сверхэкспрессирующими TrkB и 100 мкл аликвоты IAM. ПК. Упаковочный материал колонны DD2 с иммобилизованными ячейками SH-SY5Y TrkB-NULL, взвешенными в буфере ацетата аммония.
      2. Добавьте 390 мкл буфера ацетата аммония, 10 мкл раствора BDNF и 0,5 мкл исходного раствора АТФ (приготовленного на стадии 3,2) в каждую трубку и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре с раскачиванием.
    3. Для образцов, которые не будут инкубированы с BDNF до окрашивания антителами, перенесите 100 мкл аликвоты IAM. ПК. Упаковочный материал колонны DD2 с иммобилизованными клетками нейробластомы SH-SY5Y, сверхэкспрессирующими TrkB, суспендированным в ацетате аммония в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл.
    4. Добавьте в каждую пробирку 400 мкл буфера ацетата аммония и 0,5 мкл раствора АТФ (приготовленного на стадии 3,2) и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре с раскачиванием.
    5. Открутите образцы, приготовленные на этапах 7.1.2 и 7.1.4, при 4°С в течение 1 мин при 10 000 х г и выбросьте супернатант.
    6. Полученные гранулы промыть 500 мкл буфера ацетата аммония в течение 10 мин и снова вращать при 4 °C в течение 1 мин при 10 000 х г и выбросить надосадочное вещество.
    7. К каждой из гранул добавляют 220 мкл буфера ацетата аммония, 25 мкл 10% нормальной козьей сыворотки и 5 мкл первичного анти-BDNF антитела. Инкубировать в холодном помещении (4 °C) на ночь с раскачиванием.
    8. По завершении стадии инкубации открутите смесь в течение 1 мин при 10 000 х г при 4 °С и выбросьте супернатант.
    9. Вымойте полученную гранулу 3 раза буфером ацетата аммония, содержащим 1% мягкого моющего средства (например, холата натрия) в течение 10 мин и раскрутите смеси в течение 1 мин при 10 000 х г при 4 °C и выбросьте супернатант.
    10. Готовят раствор вторичных антител путем смешивания 900 мкл буфера ацетата аммония, 100 мкл 10% нормальной козьей сыворотки и 1 мкл флуорофор-конъюгированного вторичного антитела (разведение 1:1000). Добавляют 300 мкл раствора вторичных антител к каждой из гранул, полученных на стадии 7.1.9. и инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C с раскачиванием.
    11. Раскрутите смесь при 10 000 х г в течение 1 мин при 4 °C и выбросьте супернатант.
    12. Полученную гранулу промыть 3 раза буфером ацетата аммония, содержащим 1% мягкого моющего средства (например, холата натрия) в течение 10 мин и открутить смесь в течение 1 мин при 10 000 х г при 4 °C и отказаться от надосадочного вещества.
    13. Повторно суспендировать полученные гранулы в 50 мкл буфера ацетата аммония. Поместите 20 мкл каждой из смесей на слайд и накройте крышкой.
    14. Создайте изображение IAM. ПК. Частицы DD2 с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с возбуждением при 488 нм и излучением при 520 нм генерируются с помощью твердотельной лазерной системы. Используйте объектив 20x с NA 0,75 и WD 0,35 мм.
  2. Фронтальная аффинная хроматография с использованием 7,8-DHF в качестве маркерного лиганда
    1. Подключите колонку CMAC к системе ВЭЖХ с помощью детектора диодной решетки и/или масс-спектрометра.
    2. Готовят 500 мл 1 мМ раствора 7,8-ДГФ в буфере ацетата аммония, содержащем 5% метанол.
    3. Перекачиваем постоянную концентрацию маркерного лиганда (1 мМ) через колонну CMAC со скоростью потока 0,4 мл/мин при комнатной температуре. Мониторинг профиля элюирования с помощью детектора диодной решетки (DAD) (длина волны 254 нм) или масс-спектрометра (используйте режим мониторинга одиночных ионов; м/з 253 в режиме отрицательной ионизации).
    4. После завершения пробега выполните ночную промывку, запустив буфер ацетата аммония через колонну.
    5. Повторите шаги 7.2.2. - 7.2.4. используя различные концентрации маркерного лиганда (750 нМ, 500 нМ, 300 нМ), промывая колонны в течение ночи после каждого пробега. Используйте фронтальную аффинную хроматографию для расчета лиганда Kd, как подробно рассмотрено, в другом месте. 24,51 грн.
  3. Исследования смещения с Centella asiatica (L.) Urb. (готу кола) экстракт
    1. Готовят 500 мл 500 нМ раствора 7,8-ДГФ в буфере ацетата аммония, содержащем 5% метанол и 0,2% водный экстракт готу кола (10 мг/мл).
    2. Насос постоянной концентрации маркерного лиганда (500 нМ) с экстрактом через колонну при скорости потока 0,4 мл/мин при комнатной температуре. Мониторинг профиля элюирования с помощью детектора DAD (длина волны 254 нм) или масс-спектрометра (используйте режим мониторинга одиночных ионов; m/z 253 в режиме отрицательной ионизации).
    3. После завершения пробега выполните ночную промывку, запустив буфер ацетата аммония через колонну.
    4. Нанесите профили элюирования на 500 нМ 7,8-ДГФ и полученные после запуска раствора с экстрактом готу кола для проверки на смещение маркерного лиганда.

8. Отсутствующий подход пиковой хроматографии для выявления потенциальных связующих веществ TrkB из экстракта готу кола

  1. Фракционирование экстракта готу кола на колонках CMAC
    1. Подключите отдельно колонки CMAC TrkB и TrkB-NULL к системе ВЭЖХ и введите 50 мкл водного экстракта готу кола (10 мг/мл) на каждую из колонн. Насос ацетатного буфера аммония (10 мМ, рН 7,4), содержащего 5% метанола, через колонну со скоростью потока 0,4 мл/мин при комнатной температуре.
    2. Фракции собирают отдельно от колонок CMAC TrkB и TrkB-NULL следующим образом: 0-5 мин, 5-10 мин, 10-15 мин, 15-20 мин, 20-25 мин, 25-30 мин, 30-35 мин, 35-40 мин, 40-45 мин, 45-50 мин, 50-55 мин, 55-60 мин.
    3. Заморозить и лиофилизировать полученные фракции. Повторное суспендирование лиофилизированных фракций в 50 мкл метанола перед переходом к ультраэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрическому анализу.
  2. Сверхпроизводительный анализ жидкостной хроматографии квадрупольной масс-спектрометрии времени пролета (UPLC-QTOF-MS) фракций готу кольского CMAC
    1. Проанализируйте все фракции, полученные в пункте 8.1.3. использование масс-спектрометра в сочетании с системой UPLC (режим анализа UPLC-MSE ). Анализируйте фракции с помощью колонки C18 (2,1 x 50 мм, 1,7 мкм) с предварительной колонкой C18 VanGuard (2,1 мм x 5 мм, 1,7 мкм).
    2. Элюируют колонку с помощью следующих градиентных растворов со скоростью потока 0,3 мл/мин с подвижной фазой А (вода с 0,1% муравьиной кислоты) и В (ацетонитрил с 0,1% муравьиной кислоты): 0,0 мин 99% А 1% В, 1,5 мин 84% А 16% В, 5,0 мин 80% А 20% В, 7,0 мин 75% А 25% В, 10,0 мин 65% А 35% В, 20,0-24,0 мин 1% А 99% В, 25,0-29,0 мин 99% А 1% В.
    3. Установите объем впрыска для каждого образца на 3 мкл. Выполняйте MSE в разрешении положительного и отрицательного ионных режимов, с энергией столкновения при 4 В для низкой энергии и 20-35 В для высокой энергии.
    4. Используйте следующие условия источника ESI в режиме положительной ионизации: капиллярное напряжение 1,5 кВ, конус отбора проб 40 В, смещение источника 80, температура источника 100 °C, температура дезинсоляции 350 °C, расход конусного газа 38,0 л/ч, газоразделения 400 л/ч.
    5. Используйте следующие условия источника ESI в режиме отрицательной ионизации: капиллярное напряжение 1,45 кВ, конус отбора проб 40 В, смещение источника 80, температура источника 110 °C, температура дезинсоляции 300 °C, расход конусного газа 50,0 л/ч, расход газа для дезинсоляции 652 л/ч.

Результаты

В соответствии с протоколом были собраны две хроматографические колонки CMAC: одна с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны нейробластомы SH-SY5Y с гиперэкспрессированным TrkB и одна с фрагментами клеточной мембраны SH-SY5Y TrkB-NULL. Правильно собранная колонна CMAC представлена

Обсуждение

Идентификация активных соединений, присутствующих в сложных смесях специализированных метаболитов, является очень сложной задачей23. Традиционно выделяют отдельные соединения, а их активность тестируют в разных анализах. Такой подход является трудоемким и дорогостоящим...

Раскрытие информации

Лукаш Цисла сотрудничает с Regis Technologies, поставщиком IAM. ПК. Частицы DD2.

Благодарности

Z.C.A. была поддержана Советом по научным и технологическим исследованиям Турции (TUBITAK) 2219 - Международная программа постдокторских исследований. Исследование, о котором сообщается в этой публикации, было поддержано Национальным центром комплементарной и интегративной медицины Национальных институтов здравоохранения под номером 1R41AT011716-01. Эта работа также была частично поддержана грантом Американского общества фармакогнозии, грантом Regis Technologies для Лос-Анджелеса. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
7-8 Dihydroxyflavone hydrateSigma-AldrichD5446-10 mg≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrateSigma-AldrichA2383-1 g
Ammonium acetateVWR Chemicals BDHBDH9204-500 g
BDNF antibodyInvitrogenPA5-15198-400 μLPrimary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrateSigma-AldrichB6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) humanSigma-AldrichB3795-10 μgRecombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chlorideVWR AnalyticalBDH9224-1 kg
Cholic acid sodium saltAlfa AesarJ62050-100 g
Dounce homogenizerVWR71000-51640 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
EthanolSigma-Aldrich493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)VWR AnalyticalBDH-9232-500 g
Fetal bovine serumSigma-AldrichF2442-500 mLsterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solutionSigma-AldrichG8168-100 mL50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
GlycerolVWR Life ScienceE520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)Regis Technologies, Inc.1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrateVWR AnalyticalBDH9244-500 mL
MethanolSigma-Aldrich322425
Nikon C2 DUVbNikonConfocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)Life Technologies50197Z
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)Thermo Scientific36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)VWR Life ScienceK812-500 mL1x
Potassium chlorideVWR Chemicals BDH0395-1 kg
Protease inhibitor cocktailVWR Life Science AmbresoM221-1 mLProteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR8758-500 mLwith L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)Invitrogen Alexa Flour Plus 488A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-BKerafastECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell lineKerafastECP005
Snake skin dialysis tubingThermo Scientific8824510K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azideSigma-AldrichS2002
Sodium chlorideBDH VWR AnalyticalBDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 columnGE Healthcare24-4064-08
Tris-HClVWR Life Science0497-1 kg
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT4049-500 mL0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA

Ссылки

  1. Thomford, N. E., et al. Natural Products for Drug Discovery in the 21st Century: Innovations for Novel Drug Discovery. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1578 (2018).
  2. Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M. International Natural Product Sciences Taskforce, Supuran, C.T. Natural products in drug discovery: advances and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (3), 200-216 (2021).
  3. Altmann, K. H. Drugs from the Oceans: Marine Natural Products as Leads for Drug Discovery. Chimia. 71 (10), 646-652 (2017).
  4. Bernardini, S., Tiezzi, A., Laghezza Masci, V., Ovidi, E. Natural products for human health: an historical overview of the drug discovery approaches. Natural Product Research. 32 (16), 1926-1950 (2018).
  5. DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (20), 9295-9304 (2016).
  6. Lee, J., Jo, D. G., Park, D., Chung, H. Y., Mattson, M. P. Adaptive cellular stress pathways as therapeutic targets of dietary phytochemicals: focus on the nervous system. Pharmacological Reviews. 66 (3), 815-868 (2014).
  7. Hornykiewicz, O. L-DOPA: from a biologically inactive amino acid to a successful therapeutic agent. Amino Acids. 23 (1-3), 65-70 (2002).
  8. Hoyer, D. Targeting the 5-HT system: Potential side effects. Neuropharmacology. 179, 108233 (2020).
  9. Nur, S., Adams, C. E. Chlorpromazine versus reserpine for schizophrenia. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4, (2016).
  10. Chung, H. Y., et al. Redefining Chronic Inflammation in Aging and Age-Related Diseases: Proposal of the Senoinflammation Concept. Aging and Disease. 10 (2), 367-382 (2019).
  11. Fitzgerald, K. N., et al. Potential reversal of epigenetic age using a diet and lifestyle intervention: a pilot randomized clinical trial. Aging. 13 (7), 9419-9432 (2021).
  12. Zhao, L., Lee, J. Y., Hwang, D. H. Inhibition of pattern recognition receptor-mediated inflammation by bioactive phytochemicals. Nutrition Reviews. 69 (6), 310-320 (2011).
  13. Corbi, G., et al. Dietary Phytochemicals in Neuroimmunoaging: A New Therapeutic Possibility for Humans?. Frontiers in Pharmacology. 7, 364 (2016).
  14. Davinelli, S., et al. Dietary phytochemicals and neuro-inflammaging: from mechanistic insights to translational challenges. Immunity & Ageing: I & A. 13, 16 (2016).
  15. Ostan, R., et al. Inflammaging and cancer: a challenge for the Mediterranean diet. Nutrients. 7 (4), 2589-2621 (2015).
  16. Martucci, M., et al. Mediterranean diet and inflammaging within the hormesis paradigm. Nutrition Reviews. 75 (6), 442-455 (2017).
  17. Szarcvel Szic, K., Declerck, K., Vidakovic, M., Vanden Berghe, W. From inflammaging to healthy aging by dietary lifestyle choices: is epigenetics the key to personalized nutrition. Clinical Epigenetics. 7 (1), 33 (2015).
  18. Dean, E., Gormsen Hansen, R. Prescribing optimal nutrition and physical activity as "first-line" interventions for best practice management of chronic low-grade inflammation associated with osteoarthritis: evidence synthesis. Arthritis. , 560634 (2012).
  19. Ruiz-Núñez, B., Pruimboom, L., Dijck-Brouwer, D. A., Muskiet, F. A. Lifestyle and nutritional imbalances associated with Western diseases: causes and consequences of chronic systemic low-grade inflammation in an evolutionary context. TheJournal of Nutritional Biochemistry. 24 (7), 1183-1201 (2013).
  20. Agarwal, P., et al. MIND Diet Associated with Reduced Incidence and Delayed Progression of Parkinsonism in Old Age. The Journal of Nutrition, Health & Aging. 22 (10), 1211-1215 (2018).
  21. Morris, M. C., et al. MIND diet associated with reduced incidence of Alzheimer's Disease. Alzheimer's & Dementia: The Journal of the Alzheimer's Association. 11 (9), 1007-1014 (2015).
  22. Franceschi, C., Garagnani, P., Parini, P., Giuliani, C., Santoro, A. Inflammaging: a new immune-metabolic viewpoint for age-related diseases. Nature Reviews. Endocrinology. 14 (10), 576-590 (2018).
  23. Ciesla, L., Moaddel, R. Comparison of analytical techniques for the identification of bioactive compounds from natural products. Natural Product Reports. 33 (10), 1131-1145 (2016).
  24. Moaddel, R., Wainer, I. W. The preparation and development of cellular membrane affinity chromatography columns. Nature Protocols. 4 (2), 197-205 (2009).
  25. Ferrer, I., et al. BDNF and full-length and truncated TrkB expression in Alzheimer disease. Implications in therapeutic strategies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58 (7), 729-739 (1999).
  26. Numakawa, T., Odaka, H., Adachi, N. Actions of Brain-Derived Neurotrophin Factor in the Neurogenesis and Neuronal Function, and Its Involvement in the Pathophysiology of Brain Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3650 (2018).
  27. Lima Giacobbo, B., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor in Brain Disorders: Focus on Neuroinflammation. Molecular Neurobiology. 56 (5), 3295-3312 (2019).
  28. Wang, Z. H., et al. Deficiency in BDNF/TrkB Neurotrophic Activity Stimulates δ-Secretase by Upregulating C/EBPβ in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 28 (3), 655-669 (2019).
  29. Devi, L., Ohno, M. TrkB Reduction Exacerbates Alzheimer's Disease-like Signaling Aberrations and Memory Deficits without Affecting beta-Amyloidosis in 5XFAD Mice. Translational Psychiatry. 5 (5), 562 (2015).
  30. Jiao, S. S., et al. Brain-derived Neurotrophic Factor Protects against Tau-related Neurodegeneration of Alzheimer's Disease. Translational Psychiatry. 6 (10), 907 (2016).
  31. Ng, T., Ho, C., Tam, W., Kua, E., Ho, R. C. Decreased Serum Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Levels in Patients with Alzheimer's Disease (AD): A Systematic Review and Meta-Analysis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 257 (2019).
  32. Amidfar, M., de Oliveira, J., Kucharska, E., Budni, J., Kim, Y. K. The Role of CREB and BDNF in Neurobiology and Treatment of Alzheimer's Disease. Life Sciences. 257, 118020 (2020).
  33. Atasoy, I. L., et al. Both Secreted and the Cellular Levels of BDNF Attenuated due to Tau Hyperphosphorylation in Primary Cultures of Cortical Neurons. Journal of Chemical Neuroanatomy. 80, 19-26 (2017).
  34. Rosa, E., et al. Tau Downregulates BDNF Expression in Animal and Cellular Models of Alzheimer's Disease. Neurobiology of Aging. 48, 135-142 (2016).
  35. Xiang, J., et al. Delta-secretase-cleaved Tau Antagonizes TrkB Neurotrophic Signalings, Mediating Alzheimer's Disease Pathologies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 9094-9102 (2019).
  36. Giuffrida, M. L., Copani, A., Rizzarelli, E. A Promising Connection between BDNF and Alzheimer's Disease. Aging. 10 (8), 1791-1792 (2018).
  37. Ando, S., et al. Animal Model of Dementia Induced by Entorhinal Synaptic Damage and Partial Restoration of Cognitive Deficits by BDNF and Carnitine. Journal of Neuroscience Research. 70 (3), 519-527 (2002).
  38. Fischer, D. L., Sortwell, C. E. BDNF Provides Many Routes Toward STN DBS-Mediated Disease Modification. Movement Disorders. Official Journal of the Movement Disorder Society. 34 (1), 22-34 (2019).
  39. Zhang, F., Kang, Z., Li, W., Xiao, Z., Zhou, X. Roles of Brain-derived Neurotrophic Factor/Tropomyosin-related Kinase B (BDNF/TrkB) Signalling in Alzheimer's Disease. Journal of Clinical Neuroscience: Official Journal of the Neurological Society of Australasia. 19 (7), 946-949 (2012).
  40. Pilakka-Kanthikeel, S., Atluri, V. S., Sagar, V., Saxena, S. K., Nair, M. Targeted Brain Derived Neurotropic Factors (BDNF) Delivery across the Blood-Brain Barrier for Neuro-protection using Magnetic Nano Carriers: An In-vitro Study. PLoS One. 8 (4), 62241 (2013).
  41. Jang, S. W., et al. A Selective TrkB Agonist with Potent Neurotrophic Activities by 7,8-Dihydroxyflavone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (6), 2687-2692 (2010).
  42. Todd, D., et al. A Monoclonal Antibody TrkB Receptor Agonist as a Potential Therapeutic for Huntington's Disease. Plos One. 9 (2), 87923 (2014).
  43. Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-Related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
  44. Liu, X., et al. Biochemical and Biophysical Investigation of the Brain-derived Neurotrophic Factor Mimetic 7,8-Dihydroxyflavone in the Binding and Activation of the TrkB Receptor. The Journal of Biological Chemistry. 289 (40), 27571-27584 (2014).
  45. Chen, L., Gao, X., Zhao, S., Hu, W., Chen, J. The Small-Molecule TrkB Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Decreases Hippocampal Newborn Neuron Death After Traumatic Brain Injury. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 74 (6), 557-567 (2015).
  46. Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
  47. Zhang, Z., et al. 7,8-Dihydroxyflavone Prevents Synaptic Loss and Memory Deficits in a Mouse Model of Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: Official Publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 39 (3), 638-650 (2014).
  48. Casarotto, P. C., et al. Antidepressant Drugs Act by Directly Binding to TRKB Neurotrophin Receptors. Cell. 184 (5), 1299-1313 (2021).
  49. Iyer, R., et al. Entrectinib is a potent inhibitor of Trk-driven neuroblastomas in a xenograft mouse model. Cancer letters. 372 (2), 179-186 (2016).
  50. Iyer, R., et al. Nanoparticle delivery of an SN38 conjugate is more effective than irinotecan in a mouse model of neuroblastoma. Cancer letters. 360 (2), 205-212 (2015).
  51. Ng, E. S., Chan, N. W., Lewis, D. F., Hindsgaul, O., Schriemer, D. C. Frontal Affinity Chromatography-Mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (8), 1907-1917 (2007).
  52. Maciuk, A., Moaddel, R., Haginaka, J., Wainer, I. W. Screening of Tobacco Smoke Condensate for Nicotinic Acetylcholine Receptor Ligands using Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns and Missing Peak Chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (2), 238-246 (2008).
  53. Harvey, A. L., Edrada-Ebel, R., Quinn, R. J. The Re-emergence of Natural Products for Drug Discovery in the Genomics Era. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (2), 111-129 (2015).
  54. Ciesla, L., et al. Development and Characterization of the α3β4α5 Nicotinic Receptor Cellular Membrane Affinity Chromatography Column and Its Application for on line Screening of Plant Extracts. Journal of Chromatography A. 1431, 138-144 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

179

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены