Исследование от проектирования до внедрения для разработки и проверки пациентом бумажной диагностики toehold Switch

Резюме

Доступ к децентрализованной, недорогой и высокопроизводительной диагностике, которая может быть развернута в сообществе для децентрализованного тестирования, имеет решающее значение для борьбы с глобальными кризисами в области здравоохранения. В этой рукописи описывается, как построить бумажную диагностику для последовательностей вирусных РНК, которые могут быть обнаружены с помощью портативного оптического считывателя.

Аннотация

Доступ к низкой молекулярной диагностике, которая может быть развернута в сообществе для тестирования, становится все более важным и имеет значимые более широкие последствия для благополучия обществ и экономической стабильности. В последние годы появилось несколько новых изотермических диагностических методов для удовлетворения потребности в быстрой и недорогой молекулярной диагностике. Мы внесли свой вклад в эти усилия путем разработки и проверки пациентом диагностики на основе переключателей пальцев ног, включая диагностику переносимых комарами вирусов Зика и чикунгуньи, которые обеспечили производительность, сопоставимую с анализами на основе золотого стандарта обратной транскрипции и количественной полимеразной цепной реакции (RT-qPCR). Эти диагностические средства недороги в разработке и производстве, и они могут обеспечить диагностический потенциал для сред с низким уровнем ресурсов. Здесь протокол предоставляет все шаги, необходимые для разработки анализа на основе коммутатора для обнаружения вируса Зика. Статья проводит читателей через поэтапный процесс разработки диагностики. Во-первых, геномные последовательности вируса Зика служат входными данными для вычислительного проектирования коммутаторов-кандидатов с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом. Далее показана сборка датчиков для эмпирического скрининга с синтетическими последовательностями РНК и оптимизация диагностической чувствительности. После завершения валидация выполняется с образцами пациентов параллельно с RT-qPCR и специально построенным оптическим считывателем PLUM. Эта работа предоставляет техническую дорожную карту для исследователей для разработки недорогих датчиков на основе переключателей пальцев ног для применения в здравоохранении человека, сельском хозяйстве и мониторинге окружающей среды.

Введение

RT-qPCR остается золотым стандартом технологии клинической диагностики благодаря своей отличной чувствительности и специфичности. Несмотря на высокую надежность, метод зависит от дорогостоящего специализированного оборудования и реагентов, которые требуют распределения и хранения с контролируемой температурой. Это создает значительные препятствия для доступности качественной диагностики во всем мире, особенно во время вспышек заболеваний и в регионах, где доступ к хорошо оборудованным лабораториям ограничен ^1,2. Это наблюдалось во время вспышки вируса Зика в Бразилии в 2015/2016 гг. Поскольку для проведения тестирования RT-qPCR доступно только пять централизованных лабораторий, возникли значительные узкие места, ограничившие доступ к диагностике. Это было особенно сложно для людей в пригородных условиях, которые более серьезно пострадали от вспышки ^3,4. В целях улучшения доступа к диагностике протокол демонстрирует платформу, которая была разработана с потенциалом для обеспечения децентрализованной, недорогой и высокопроизводительной диагностики в условиях ограниченных ресурсов. В рамках этого был создан диагностический конвейер обнаружения, соединяющий изотермическую амплификацию и синтетические датчики на основе переключателей РНК с бумажными системами бесклеточной экспрессии ^5,6.

Системы бесклеточного синтеза белка (CFPS), в частности бесклеточные системы на основе E. coli, являются привлекательной платформой для широкого спектра применений биозондирования от мониторинга окружающей среды ^7,8 до диагностики патогенов ^{5,6,9,10,11,12} . Содержащие компоненты, необходимые для транскрипции и трансляции, системы CFPS имеют значительные преимущества перед полноклеточными биосенсорами. В частности, зондирование не ограничено клеточной стенкой и, как правило, они являются модульными по конструкции, биобезопасными, недорогими и могут быть сублимированы для портативного использования. Способность сублимировать реакции на основе генной цепи на подложках, таких как бумага или текстиль, обеспечивает транспортировку, длительное хранение при комнатной температуре⁵ и даже включение в носимую технологию¹³.

Предыдущая работа показала, что бесклеточные системы E. coli могут быть использованы для обнаружения многочисленных аналитов, например, токсичных металлов, таких как ртуть, антибиотиков, таких как тетрациклин ^7,14, химических веществ, разрушающих эндокринную систему ^15,16, биомаркеров, таких как гиппуровая кислота¹⁷, патоген-ассоциированных молекул кворума ^9,18 и запрещенных веществ, таких как кокаин¹⁷ и гамма-гидроксибутират (ГОМК)¹⁹ . Для определения последовательности нуклеиновых кислот стратегии по большей части основывались на использовании биосенсоров на основе переключателей, связанных с методами изотермической амплификации. Переключатели Toehold представляют собой синтетические риборегуляторы (также называемые просто «переключателями» в остальной части текста), которые содержат структуру шпильки, которая блокирует нисходящую трансляцию путем секвестрации сайта рибосомального связывания (RBS) и стартового кодона. При взаимодействии с их целевой триггерной РНК структура шпильки снимается и включается последующая трансляция репортера открытого кадра считывания²⁰.

Изотермическая амплификация также может быть использована в качестве молекулярной диагностики²¹; однако эти методы подвержены неспецифическому усилению, что может снизить специфичность и, следовательно, точность теста ниже, чем у RT-qPCR ²². В работе, представленной здесь, изотермическое усиление перед датчиками на основе переключателей использовалось для обеспечения комбинированного усиления сигнала, которое позволяет клинически значимо обнаруживать нуклеиновые кислоты (от фемтомолярных до аттомолярных). Это сопряжение двух методов также обеспечивает две специфичные для последовательности контрольные точки, которые в сочетании обеспечивают высокий уровень специфичности. Используя этот подход, предыдущая работа продемонстрировала обнаружение таких вирусов, как Зика⁶, Эбола⁵, Норовирус¹⁰, а также патогенных бактерий, таких как C. difficile²³ и устойчивый к антибиотикам брюшной тиф¹². Совсем недавно были продемонстрированы бесклеточные переключатели для обнаружения SARS-CoV-2 в целях обеспечения доступной диагностики пандемии COVID-19 11,12,13.

В следующем протоколе описывается разработка и валидация бесклеточного синтетического анализа на основе бумаги для обнаружения вируса Зика, от проектирования биосенсора in silico через этапы сборки и оптимизации до полевой валидации с образцами пациентов. Протокол начинается с проектирования in silico датчиков на основе переключателей РНК и праймеров изотермической амплификации, специфичных для вирусной РНК Зика. Хотя существует множество методов изотермической амплификации, здесь было продемонстрировано использование амплификации на основе последовательности нуклеиновых кислот (NASBA) для повышения концентрации вирусной РНК-мишени, присутствующей в реакции, что обеспечивает клинически значимую чувствительность. Практически, методы изотермического усиления имеют преимущество работы при постоянной температуре, устраняя необходимость в специализированном оборудовании, таком как тепловые циклеры, которые, как правило, ограничены централизованными местоположениями.

Далее описан процесс сборки синтетических датчиков переключателя с репортерными кодирующими последовательностями через перекрывающую ПЦР расширения и скрининга синтетических датчиков переключателя на носок для оптимальной производительности в бесклеточных системах с использованием синтетической РНК. Для этого набора датчиков вируса Зика мы выбрали ген lacZ , кодирующий фермент β-галактозидазы, который способен расщеплять колориметрический субстрат, хлорфенол красного β-D-галактопиранозид (CPRG), чтобы произвести изменение цвета от желтого до фиолетового, которое может быть обнаружено глазом или с помощью считывателя пластин. Как только наиболее эффективные синтетические переключатели идентифицированы, описан процесс скрининга праймеров для изотермической амплификации соответствующей целевой последовательности на основе последовательностей нуклеиновых кислот с использованием синтетической РНК для поиска наборов, обеспечивающих наилучшую чувствительность.

Наконец, производительность диагностической платформы проверяется на месте в Латинской Америке (рисунок 1). Для определения клинической диагностической точности проводится бумажный бесклеточный анализ с использованием образцов вируса Зика от пациентов; параллельно для сравнения проводится анализ RT-qPCR золотого стандарта. Для мониторинга колориметрических бесклеточных анализов мы обеспечиваем количественную оценку результатов на месте в регионах, где тепловые циклеры недоступны. Собранный вручную считыватель пластин под названием Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; далее именуемый портативным считывателем пластин) также представлен здесь²⁴. Первоначально разработанный в качестве сопутствующего устройства для бесклеточной диагностики синтетических переключателей пальцев ног, портативный считыватель пластин предлагает доступный способ инкубации и считывания результатов с высокой пропускной способностью, обеспечивая интегрированный анализ программного обеспечения на основе компьютерного зрения для пользователей.

Рисунок 1: Рабочий процесс для тестирования образцов пациентов с использованием бумажных бесклеточных реакций переключения пальцев ног. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 

протокол

Все процедуры с участием людей должны проводиться в соответствии с этическими стандартами и соответствующими руководящими принципами, включая этические принципы медицинских исследований с участием людей, установленные Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации. Это исследование было одобрено комитетом по этике исследований человека под номером лицензионного протокола CAAE: 80247417.4.0000.5190. Информированное согласие всех пациентов, включенных в это исследование, было отменено Советом по институциональному обзору Fiocruz-PE (IRB) для диагностических образцов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Далее устройство PLUM будет именоваться "портативным считывателем пластин".

1. Вычислительное проектирование праймеров амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот

1. Сканируйте геном Зика, чтобы идентифицировать набор областей-кандидатов для амплификации, которые составляют примерно от 200 нуклеотидов (nt) до 300 nt в длину, помещая геномную последовательность в NCBI / Nucleotide BLAST^25,26. Сравните геном с эталонными последовательностями РНК (refseq_rna) и найдите участки, которые остаются высококонсервативными и не имеют гомологии с геномом человека (другие параметры BLAST остаются неизменными). Выберите по крайней мере два сайта для разработки синтетического переключателя toehold.
2. Используйте критерии отбора Deiman et ^al.27 для генерации пар праймеров амплификации на основе последовательностей прямых и обратных нуклеиновых кислот для каждой области амплификации-кандидата. Вкратце, следуйте следующим критериям проектирования грунтовок: (1) содержание ГК в пределах 40%-60%; (2) от 20 до 24 нт в длину при температуре плавления ДНК выше 41 °C; (3) отсутствие прогонов четырех или более идентичных нуклеотидов; (4) конечный 3' нуклеотид является основанием А; (5) низкая вторичная структура грунтовки и вероятность образования димера. Экран 8-10 пар грунтовки для каждого целевого региона (рекомендуется).
3. Добавьте префиксную последовательность, содержащую промоторную последовательность T7 AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG (подчеркнутая промоторная последовательность T7) к 5'-концу прямых праймеров, чтобы обеспечить транскрипцию ампликонов с использованием T7 РНК-полимеразы (RNAP). Закажите праймеры в виде ДНК-олиго у компании по синтезу ДНК.

2. Вычислительное проектирование носочных переключателей

1. Установите NUPACK²⁸ версии 3.2 (nucleic acid design suite) на основе инструкций на сайте²⁹. Используйте операционную систему UNIX и MATLAB (числовую вычислительную платформу) в качестве языка программирования (рекомендуется).
2. Определите целевые последовательности (например, вирусный геном), специфичные для патогена, представляющего интерес для конструкций переключателей toehold, как на этапе 1.1. Выберите целевые последовательности вируса Зика из ампликонов на основе последовательностей нуклеиновых кислот, сгенерированных на шаге 1.2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На практике в зависимости от потребностей пользователей могут быть спроектированы и протестированы либо праймеры амплификации на основе последовательности нуклеиновых кислот, либо синтетические переключатели для удержания пальцев ног. Если конкретные целевые области, представляющие интерес, уже установлены (например, из существующих публикаций или диагностических протоколов), сначала может произойти проектирование и скрининг переключателя на носок, за которым следует проектирование и скрининг праймеров амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот. Если нет установленных целевых областей, первый экран амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот сравнивает с полным геномом, чтобы сузить мишени выбора при выборе эффективности амплификации праймера. Если доступно несколько последовательностей для патогена, лучше всего разработать праймеры амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот, которые фокусируются на высококонсервативных областях (а не на скрининге всего генома).
3. Загрузите и установите необходимое программное обеспечение MATLAB на компьютер.
4. Настройте переменные среды, чтобы функции пакета нуклеиновых кислот вызывались в программном обеспечении. Для этого откройте программу, а затем откройте (или создайте) файл startup.m в рабочей папке по умолчанию. Затем скопируйте следующие строки кода в файл startup.m и, наконец, добавьте папку, содержащую двоичные файлы пакета нуклеиновых кислот в PATH:
   NUPACKINSTALL = '/Users/[user_name]/.../nupack3.2.2';
   setenv('NUPACKINSTALL',NUPACKINSTALL);
   setenv('PATH',[getenv('PATH'),sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]);
5. Откройте программное обеспечение числовой вычислительной платформы и перейдите в папку программного обеспечения для проектирования. Запустите алгоритмы проектирования, доступные на https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN.
6. Введите целевые последовательности в design_input_file.csv, расположенную во входной вложенной папке. Входные данные включают Имя, Внешняя последовательность, Внутренняя последовательность, Температура, Выходное имя и Выходная последовательность, как определено в таблице 1. Если для цели еще не определены участки грунтовки, сохраните внутреннюю и внешнюю последовательности одинаковыми. Только первые 29 nt репортера будут рассмотрены в процессе проектирования. По завершении сохраните и закройте обновленную электронную таблицу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выходная последовательность представляет собой последовательность репортерного белка, который планируется использовать для анализа (например, lacZ). Указание внутренней и внешней последовательностей гарантирует, что алгоритм не будет генерировать синтетические переключатели пальцев ног, которые перекрываются ни с одним из праймеров. Это также гарантирует, что анализ распознает три уникальных участка в геноме Зика для улучшения его специфичности.
7. Выберите параметры для функции проектирования: toehold_switch_design_run (num_designs,input_file, опции). Заполните значения параметров следующим образом:
   1. num_designs - количество топовых дизайнов для каждого целевого вывода программным обеспечением. Значение по умолчанию равно 6 и может быть изменено по мере необходимости (рекомендуется минимум шесть дизайнов для каждой цели).
   2. input_file - этот параметр указывает имя файла, предоставляющего информацию о входной последовательности. Значение по умолчанию — 'design_input_file.csv' и может быть изменено по мере необходимости.
   3. Выберите один из следующих вариантов - (1) SeriesA и SeriesB: версия (версии) переключателя toehold, который будет генерировать код. Установите Для параметра SeriesB значение 1 и для параметра SeriesA значение 0 для создания переключателя серии B toehold, который является форматом, используемым в диагностике вируса Зика⁶; (2) Параллельный: установите значение 1 для использования нескольких ядер для вычисления конструкций; в противном случае установите значение 0; (3) Antisense: установите значение 1 для генерации переключателей toehold, которые гибридизируют антисмысловую последовательность (т.е. обратное дополнение) целевого входа; в противном случае установите значение 0.
8. Запустите функцию проектирования, используя выбранные параметры: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). Затем алгоритм начнет генерировать конструкции переключателя toehold для интересующих целей.
9. По завершении проектирования найдите последовательности проектирования переключателей верхнего носка и соответствующие целевые последовательности в папке final_designs в виде электронных таблиц формата .csv. Последовательности ДНК переключателя пальцев ног, генерируемые алгоритмом, будут содержать последовательность промотора T7 на конце 5' и законсервированную 21-нтовую линкерную последовательность AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG на 3'-конце.
10. Экранируйте полученные последовательности проектирования переключателей верхнего пальца ноги против других распространенных вирусов, помещая их на NCBI-BLAST и проверяя гомологию последовательностей. Принимайте последовательности с 40% гомологией или менее.
11. Закажите последовательности шпильки переключателя пальцев ног в виде олигов ДНК, а затем соберите их с геном репортера в полностью функциональные переключатели. Закажите необходимые праймеры ПЦР для последующей сборки датчика в зависимости от выбранного репортерного белка.

Параметр	Определение
Имя	Требуемые имена последовательностей выходного переключателя toehold.
Внешняя последовательность	Полная расшифровка NASBA получена из амплификации.
Внутренняя последовательность	Внешняя последовательность, исключающая сайты связывания грунтовки. Он соответствует внешней последовательности, но исключает части транскриптов, которые связываются с прямыми и обратными праймерами.
Температура	Температура, используемая алгоритмами для вычисления структур РНК.
Выходное имя	Название выходного гена (например, lacZ, gfp).
Выходная последовательность	Последовательность выходного гена.

Таблица 1: Определение каждого параметра, используемого в программном обеспечении toehold switchdesign.

3. Конструкция носочных выключателей методом ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги описывают конструкцию носочных переключателей LacZ с помощью перекрывающего расширения ПЦР. Здесь олиго ДНК используется в качестве прямого праймера, а терминатор Т7 используется в качестве обратного праймера. Мы используем плазмиду pCOLADuet-LacZ в качестве шаблона для гена lacZ (addgene: 75006). Любые другие шаблоны ДНК, содержащие соответствующую последовательность, могут быть использованы в качестве шаблонов при условии, что терминатор Т7 включен в окончательную конструкцию.

1. После получения синтетических олиго ДНК от коммерческого поставщика готовят растворы синтетической ДНК и праймера обратной амплификации в концентрации 10 мкМ в воде без нуклеазы. Собирают реакции в ПЦР-трубках на льду согласно таблице 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы ПЦР могут быть масштабированы по мере необходимости. Используйте минимальное количество (0,1-1 нг) шаблона ДНК pCOLADuet-LacZ, чтобы избежать необходимости в дополнительном этапе удаления плазмиды или фоновом сигнале LacZ. Для более высоких количеств шаблона ДНК следуйте ПЦР с перевариванием фермента рестрикции DpnI, чтобы удалить остаточный шаблон плазмиды.
2. Поместите реакции в термоциклер в соответствии с условиями циклирования, перечисленными в таблице 3. Анализ продуктов ПЦР на агарозном геле (рисунок 2; см. Дополнительный протокол и³⁰).
3. Очистите продукты ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР на основе спиновой колонки и элюируйте ДНК в 15-30 мкл воды без нуклеазы в соответствии с инструкциями производителя. Количественно оцените ДНК с помощью спектрофотометра.

Компонент	Том	Концентрация
5X Q5 реакционный буфер	10 мкл	в 1 раз
10 мМ дНТП	1 мкл	200 мкМ
10 мМ Прямая грунтовка (синтетический переключатель ДНК FW)	2.5 мкл	0.5 мкМ
10 мМ Обратная грунтовка (терминатор T7 RV)	2.5 мкл	0.5 мкМ
Шаблон ДНК (pCOLADuet-LacZ)	переменная	<1 нг
Q5 Высококачественная ДНК-полимераза	0.5 мкл	0,02 ЕД/мкл
Вода без нуклеаз	до 50 мкл	-

Таблица 2: Компоненты ПЦР, используемые для построения носовых переключателей.

Шаг		Температура	Время
Начальная денатурация		98 °С	30 с
35 циклов	Денатурация	98 °С	10 с
	Отжиг	60 °С	20 с
	Расширение	72 °С	1,45 мин
Окончательное продление		72 °С	5 мин
Держать		4 °С	-

Таблица 3: Условия цикличности, используемые при изготовлении точечных переключателей методом ПЦР.

4. Получение синтетической РНК-мишени (триггера)

1. Используя программное обеспечение для проектирования молекулярной биологии, измените синтетические шаблоны триггерной РНК (выбранные на шаге 1.1), чтобы включить восходящую последовательность промотора T7, гарантируя, что полный шаблон останется коротким (<200 bp). Разрабатывайте прямые и обратные праймеры для усиления праймера триггерной последовательности (для последовательностей олиго см. Дополнительный протокол).
2. Упорядочивайте последовательности как олигосы ДНК. После получения восстановите синтетический триггер ДНК и праймеры амплификации до 10 мкМ в воде без нуклеазы. Соберите соответствующие ПЦР в тонкостенные трубки на льду согласно таблице 2 и используйте 0,5 мкл триггерного ультрамера ДНК (конечная концентрация 0,1 мкМ) в качестве шаблонной ДНК.
3. Поместите реакции в термоциклер и используйте условия цикла, перечисленные в таблице 3. Используйте время продления 15 с. Оценить качество и очистить триггерные продукты ПЦР, как описано в шаге 3.3 и Дополнительном протоколе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для ускорения процесса очищенные колонкой триггерные продукты ПЦР также могут быть непосредственно использованы для первоначального скрининга переключателя пальцев ног.

5. Транскрипция in vitro выбранных триггерных последовательностей

1. Соберите реакционные компоненты на льду согласно таблице 4.
2. Инкубационные реакции транскрипции in vitro (IVT) при 37 °C в течение 4 ч с последующим лечением ДНКазой I для удаления шаблонной ДНК. Для стадии ДНКазы I добавляют 70 мкл воды без нуклеазы, 10 мкл 10-кратного буфера ДНКазы I и 2 мкл ДНКазы I (без РНКазы) и инкубируют при 37 °C в течение 15 мин. Если не перейти к шагу 5.4 немедленно, инактивируют ДНКазу I с добавлением 50 мМ ЭДТА и инактивацией тепла при 65 °C в течение 10 мин.
3. Необязательный этап: Выполните денатурирующий электрофорез полиакриламидного геля (например, мочевины-PAGE) на продуктах IVT для оценки качества РНК, как описано в Дополнительном протоколе.
4. Очистите триггерные продукты IVT с помощью набора для очистки РНК на основе столбцов в соответствии с инструкциями производителя, а затем количественно оцените концентрацию и чистоту РНК с помощью спектрофотометрии. См. Дополнительный протокол для получения инструкций о том, как определить молярность и число копий/мкл РНК.

Компонент	Том	Концентрация
Реакционный буфер 10X	1.5 мкл	в 0,75х
25 мМ NTP микс	6 мкл	7.5 мМ
Шаблон триггера ДНК	X мкл	1 мкг
T7 РНК полимеразная смесь	1.5 мкл	-
Вода без нуклеаз	X мкл	До 20 мкл

Таблица 4: Транскрипция in vitro (IVT) отдельных триггерных последовательностей.

6. Начальный скрининг переключателей

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются шаги, связанные с настройкой реакций безячеистого бумажного переключателя носка, а также способы проверки высокопроизводительных переключателей носочных удержаний. Фильтровальная бумага, используемая на этапе 6.10, должна быть подготовлена заранее, как описано в Дополнительном протоколе.

1. Приготовьте раствор CPRG, растворив 25 мг порошка в 1 мл воды без нуклеазы. Держите раствор на льду в любое время и храните при -20 °C для длительного использования.
2. Определите количество реакций для настройки. Для каждого оцениваемого переключателя toehold включите элемент управления без шаблона (без переключателя и без целевой РНК, иначе известный как бесклеточный одиночный контроль), чтобы учесть любой фоновый сигнал, который может возникнуть из мастер-микса. Включите переключатель только для управления для оценки утечки фонового переключателя или скорости выключения при отсутствии целевой РНК.
3. Соберите бесклеточную реакционную мастер-смесь раствора А, раствора В, ингибитора РНКАЗЫ и CPRG на льду в соответствии со стандартным протоколом, перечисленным в таблице 5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, описанные здесь, предназначены для мастер-смеси, которой будет достаточно для тройного набора реакций 1,8 мкл с добавленным объемом 10% для учета ошибки пипетирования. Громкость основного микса должна быть отрегулирована по мере необходимости в зависимости от количества экранированных переключателей toehold.
4. Для каждой тройной бесклеточной реакции дозируйте мастер-микс в ПЦР-трубку, сохраняя все трубки на льду. Для трубки, отведенной в качестве бесклеточного контроля, добавьте воду без нуклеазы к конечному объему 5,84 мкл, перемешайте путем пипетирования вверх и вниз и ненадолго центрифугируйте. К остальным пробиркам добавляют очищенную ПЦР ДНК переключателя до конечной концентрации 33 нМ.
5. Для трубок, отведенных в качестве пульта управления только переключателем, добавьте воду без нуклеазы к конечному объему 5,84 мкл. Для пробирок, отведенных для тестирования комбинации носкового рычага и целевой РНК, добавьте транскрибированную in vitro целевую РНК до конечной концентрации 1 мкМ. Затем добавьте воду без нуклеазы к конечному объему 5,84 мкл. Тщательно перемешайте все реакции путем пипетирования вверх и вниз и кратковременно центрифугируйте.
6. Добавьте 30 мкл безнуклеазной воды в скважины, окружающие реакционные скважины, на 384-луночной черной, прозрачной донной пластине. Это минимизирует испарение в ходе эксперимента и улучшает воспроизводимость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете портативное устройство считывания пластин, поместите ПЦР-пленку на пластину и используйте прецизионный нож, чтобы вырезать колодцы, предназначенные для вашей реакции, а также каждый из четырех угловых колодцев. Пленка ПЦР предотвращает чрезмерное воздействие портативной камеры считывателя пластин из пустых колодцев.
7. Используя 2-миллиметровый перфоратор и пинцет, вырежьте диски фильтрующей бумаги, заблокированные BSA, и поместите их в реакционные колодцы либо путем выброса перфоратора, либо с помощью пинцета (см. Дополнительный протокол приготовления фильтровальной бумаги, заблокированной BSA). Распределите трипликатные объемы 1,8 мкл из каждой реакционной трубки на диски фильтровальной бумаги в 384-луночной пластине, сохраняя все образцы, а также пластину с 384 лунками на льду в любое время.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании портативного устройства считывания пластин добавьте 1,8 мкл CPRG (0,6 мг/мл) в каждый из четырех углов 384-луночной пластины. Желтый цвет от CPRG обеспечивает распознавание образов портативного считывателя пластин для выравнивания цифрового шаблона многоскважинной пластины при анализе изображений. Накройте колодцы пластины ПЦР-пленкой для предотвращения испарения.
8. Поместите пластину в устройство считывания пластин, считывайте OD₅₇₀ при 37 °C каждые минуты в течение 130 минут.

Компонент	Том	Конечная концентрация на реакцию
Решение А	2.38 мкл	40%
Решение B	1.78 мкл	30%
Ингибитор РНКАЗЫ	0.03 мкл	0,5% v/v
CPRG (25 мг/мл)	0.14 мкл	0,6 мг/мл
Переключатель Toehold	X мкл	33 нМ
Целевая РНК	X мкл	1 мкМ
Вода без нуклеаз	до 5,94 мкл	-
Общий объем:		5.94 мкл

Таблица 5: PURExpress бесклеточные компоненты реакции транскрипции-трансляции.

7. Идентификация высокопроизводительных переключателей на носок

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается, как проанализировать данные из шага 6, чтобы выбрать наиболее эффективные переключатели toehold для продвижения вперед.

1. Начинают анализ данных сначала нормализуя на фоне поглощения OD₅₇₀. Для этого вычтите измерения OD₅₇₀ реакций, которые не имеют переключателя или целевой РНК (т.е. бесклеточных только скважин) из других измерений OD₅₇₀ .
2. Сгладьте нормализованные данные с помощью трехточечной скользящей средней и скорректируйте минимальное значение каждой скважины до нуля. См. рисунок 3 для примера нормализованных данных о ходе времени, собранных для переключателей 27B, 33B и 47B.
3. Используя эти обработанные данные, рассчитайте изменение складки (или отношение ON/OFF) путем определения разницы в скорости изменения цвета (т.е. изменения OD₅₇₀ с течением времени) между переключателем носока и целью и переключите только скважины (см. Дополнительный протокол для расчета соотношения; Рисунок 4).
4. Выберите переключатели с наибольшим изменением сгиба ON/OFF для дальнейшей характеристики. Опустите плохо работающие переключатели toehold, которые отображают наименьшее изменение складки.

8. Скрининг и чувствительность праймера амплификации на основе последовательности нуклеиновых кислот

ПРИМЕЧАНИЕ: На следующих этапах сначала делается экран для функциональных праймеров изотермической амплификации, а затем оценивается их чувствительность путем определения количества копий целевой РНК на мкл синтетической РНК, которые данный переключатель может надежно обнаружить в сочетании с изотермической амплификацией. После изотермической амплификации выполняют бесклеточные реакции для выявления успешных наборов праймеров амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот. Тем не менее, может быть более экономически эффективным запускать полиакриламидные или агарозные гели на реакциях амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот, чтобы сначала сузить пул наборов праймеров-кандидатов. В этом случае наборы праймеров амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот, которые генерируют полосу на геле при соответствующем размере ампликона, могут быть сокращены для последующего бесклеточного скрининга.

1. Сделайте 25 мкМ запасного раствора всех наборов прямых и обратных праймеров в воде без нуклеазы (см. Дополнительный протокол). Определите количество реакций амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот и последующих бесклеточных реакций, которые необходимо настроить. Это будет зависеть от количества переключателей носков и соответствующих наборов праймеров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При скрининге праймеров важно всегда включать элемент управления без шаблона для каждого набора праймеров, чтобы учесть любые фоновые артефакты, которые могут возникнуть из-за неспецифического усиления, связанного с праймером.
2. Настройте одну реакцию 5 мкл следующим образом (масштабируйте ее по мере необходимости). Разморозьте все реагенты на льду. Соберите реакционную мастер-смесь реакционного буфера, нуклеотидной смеси и ингибитора РНКазы согласно таблице 6. Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз до тех пор, пока белый осадок не солюбилизируется, а затем распределите аликвоты в трубки ПЦР.
   1. Если мастер-микс предназначен для экранирования праймеров амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот, сначала исключите праймеры из мастер-микса (дозируйте 2,55 мкл мастер-микса). В противном случае, при проведении анализа чувствительности грунтовки, грунтовки могут быть включены в мастер-микс (в этом случае дозируют 2,75 мкл аликвот). Добавьте ферментную смесь после стадий денатурации и уравновешивания.
3. При просеивании праймеров амплификации нуклеиновых кислот на основе последовательности добавляют прямые и обратные праймеры к соответствующим лампочкам. На термоциклере настройте протокол инкубации, как описано в таблице 7.
4. Добавьте 1 мкл либо воды без нуклеазы, либо 1 мкл целевой триггерной РНК при 2 пМ или примерно 10⁶ копиях/мкл, обязательно маркируя трубки соответствующим образом. Перемешайте путем мягкой пипетки и ненадолго раскрутите трубки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для скрининга набора праймеров используйте концентрацию целевой триггерной РНК, которая достаточно высока, чтобы не затрагивать нижний предел обнаружения метода изотермической амплификации, но недостаточно высока, чтобы обеспечить активацию переключателя toehold, если амплификация не произойдет.
5. Переместите трубки в термоциклер и начните инкубацию. Через 12 мин снимите пробирки и добавьте в каждую пробирку по 1,25 мкл ферментной смеси. Перемешайте путем пипетки вверх и вниз и кратковременно центрифугируйте трубки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе трубки могут храниться при комнатной температуре; однако ферментную смесь следует держать на льду до тех пор, пока она не будет добавлена в трубки.
6. Верните трубки в термоциклер, пропустив этап удержания 41 °C, чтобы начать инкубацию реакции за 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации реакции могут быть помещены на лед для обработки в тот же день или заморожены при -20 °C для последующей обработки.
7. Выполните шаги 6.2-6.7 и Таблицу 8 , чтобы собрать реакции безячеистого переключателя на бумажной основе для оценки производительности грунтовки. Анализируйте данные, как описано в шагах 7.1-7.2 и на рисунке 3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к вышеупомянутым ранее средствам контроля важно также включить отрицательный контроль для учета любого фонового сигнала, который может возникнуть в результате реакции. Кроме того, важно также включить управление с переключателем и 2 пМ (конечная концентрация) целевой РНК, в качестве контроля амплификации без NASBA.
8. Определите пары-кандидаты для продвижения вперед с анализом чувствительности. Пары праймеров выбираются в зависимости от того, происходит ли активация переключателя носка после добавления инкубированной реакции. При необходимости повторите грунтовочный экран с большим количеством комбинаций грунтовок.
9. Сохраняя образцы РНК на льду в любое время, сделайте следующий последовательный разбавляющий набор целевых РНК в воде без нуклеаз: 10⁴, 10³, 10², 10¹ и 10⁰ копий РНК / мкл. Повторите амплификацию на основе последовательности нуклеиновых кислот и бесклеточные реакции с выбранными наборами праймеров (шаги 8.2-8.7), тестируя серию последовательного разбавления с целью выявления наборов праймеров, которые обеспечивают наилучшую чувствительность. Пример результатов для определения чувствительности набора праймеров приведен на рисунке 5 .
   ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, выбранный переключатель носкового держателя и пара праймеров должны обнаружить всего 1-100 копий целевой РНК на мкл РНК (концентрация исходного раствора).
10. Повторите эксперимент по амплификации чувствительности на основе последовательности нуклеиновых кислот в биологическом трипликате. Этот шаг служит для подтверждения воспроизводимости результатов перед переходом к экспериментам с образцами пациентов.
11. Необязательный: Чтобы иметь надежный источник ДНК переключателя для длительного использования и для транспортировки, клонируйте выбранную последовательность (последовательности) переключателя в плазмиду с использованием любого обычного метода клонирования. Аналогичным образом, последовательность РНК целевого триггера также может быть клонирована в плазмиду по выбору для хранения.

Компонент	Объем на реакцию	Конечная концентрация
Реакционный буфер NASBA	1.67 мкл	в 1 раз
НАСБА Нуклеотидная смесь	0.833 мкл	в 1 раз
25 мкМ Прямая грунтовка	0.1 мкл	0.5 мкМ
25 мкМ Обратная грунтовка	0.1 мкл	0.5 мкМ
Ингибитор РНКАЗЫ (40 Ед/мкл)	0.05 мкл	0,4 ЕД/мкл
Целевая РНК	1 мкл
Ферментная смесь NASBA	1.25 мкл	в 1 раз
Общий объем	5 мкл

Таблица 6: Реакционные компоненты NASBA.

Шаг	Температура	Время
Денатурация	65 °С	2 мин
Равновесие	41 °С	10 мин
Держать	41 °С	∞
Инкубация	41 °С	1 ч
Держать	4 °С	-

Таблица 7: Условия реакции для NASBA.

Компонент	Том	Конечная концентрация на реакцию
Решение А	2.38 мкл	40%
Решение B	1.78 мкл	30%
Ингибитор РНКАЗЫ	0.03 мкл	0,5% v/v
CPRG (25 мг/мл)	0.14 мкл	0,6 мг/мл
Переключатель Toehold	X мкл	33 нМ
Целевая РНК (если применимо)	X мкл	1 мкМ
НАСБА (если применимо)	0.85 мкл	1:7
Вода без нуклеаз	до 5,94 мкл	-
Общий объем:		5.94 мкл

Таблица 8: Безклеточные реакционные компоненты на бумажной основе.

9. Сбор образцов пациентов и экстракция вирусной РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается протокол сбора образцов пациента и извлечения РНК с использованием набора для очистки РНК. Приведенный ниже протокол используется для получения сыворотки из периферической крови. Образцы, использованные в этом исследовании, были собраны у пациентов с лихорадкой, экзантемой, артралгией или другими связанными симптомами арбовирусной инфекции в штате Пернамбуку, Бразилия.

1. Соберите образцы периферической крови у пациентов с подозрением на заражение арбовирусом. Выполните венипунктуру (цельную пробирку крови) с использованием стандартной асептической техники. Пометьте пробы анонимным кодом и датой сбора пробы.
2. Центрифугируют кровь для отделения сыворотки по 2 300 х г в течение 10 мин. Используя пипетку, подготовьте аликвоты сыворотки (200 мкл), которые будут использоваться для экстракции РНК в пробирках по 1,5 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если невозможно выполнить экстракцию РНК вскоре после отбора проб, образцы сыворотки должны храниться при -80 °C до последующих применений.
3. Пипетка 560 мкл подготовленного буфера AVL (буфер вирусного лизиса), содержащего несущую РНК, в трубку объемом 1,5 мл. Добавьте 140 мкл сыворотки в буферную смесь AVL/несущей РНК в пробирке. Перемешивать импульсно-вихревым способом в течение 15 с.
4. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем ненадолго центрифугировать образец для сбора содержимого на дне пробирки. Добавьте к образцу 560 мкл этанола (96%-100%) и перемешайте импульсно-вихревым методом в течение 15 с. После смешивания центрифугируйте образец, чтобы собрать содержимое в нижней части пробирки.
5. Осторожно добавьте 630 мкл раствора со стадии 9.4 в спин-колонну, не смачивая ободок. После этого шага закройте колпачок и центрифугу при 6000 х г в течение 1 мин. Поместите отжимную колонну в чистую сборную трубку объемом 2 мл и выбросьте использованную сборную трубку, содержащую фильтрат.
6. Осторожно откройте спин-колонку и повторите шаг 9.5. Осторожно откройте спин-колонку и добавьте 500 мкл буфера AW1 (промывочный буфер 1). Закройте колпачок и центрифугу при 6 000 х г в течение 1 мин. Поместите отжимную колонну в чистую сборную трубку объемом 2 мл и выбросьте использованную сборную трубку, содержащую фильтрат.
7. Осторожно откройте спин-колонну и добавьте 500 мкл буфера AW2 (промывочный буфер 2). Закройте колпачок и центрифугу при 20 000 х г на 3 мин. Поместите отжимную колонну в чистую сборную трубку объемом 2 мл и выбросьте использованную сборную трубку, содержащую фильтрат.
8. Чтобы избежать загрязнения остаточным буфером AW2, который может вызвать проблемы в последующих ферментативных реакциях, поместите спин-колонну в чистую коллекторную трубку объемом 2 мл и выбросьте использованную коллекторную трубку с фильтратом. Центрифуга при 20 000 х г в течение 1 мин.
9. Поместите отжимную колонну в чистую трубку объемом 1,5 мл и выбросьте использованную сборную трубку с фильтратом. Осторожно откройте спин-колонну и добавьте 60 мкл буфера AVE (буфер элюирования), уравновешенного до комнатной температуры. После этого шага закройте колпачок и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 мин.
10. Центрифуга при 6 000 х г в течение 1 мин. Затем элюированная РНК может быть использована в качестве входных данных для NASBA и RT-qPCR параллельно.
11. Выполните шаги с 8.3 по 8.11 для выполнения амплификации на основе последовательности нуклеиновых кислот и бумажных бесклеточных реакций с использованием 1 мкл экстрагированной РНК пациента, обеспечивая включение отрицательных и положительных контрольных реакций. После реакций подготовьте реакционную пластину с 384 лунками и проведите анализ в портативном устройстве считывателя пластин при 37 °C (см. подробности в Дополнительном протоколе).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Две концентрации РНК 10⁴ и 10² ПФЕ/мл, извлеченные из культивируемого вируса Зика, используются в качестве положительного контроля для всех экспериментов во время клинической валидации. В дополнение к ранее упомянутым элементам управления важно также включить триггер (10 нг / мкл) в качестве положительного элемента управления.
12. В конце каждого эксперимента необработанные данные (.csv файл) из считывателя пластинчатого стола могут быть загружены в безопасную базу данных в Интернете. Кроме того, портативный считыватель пластин генерирует отчет, указывающий, являются ли образцы положительными или отрицательными на вирус Зика (рисунок 6); примеры всех графиков, полученных во время инкубации, см. в разделе репрезентативных результатов (рисунок 7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи также могут передавать файлы с портативного устройства чтения пластин на свой компьютер через USB.

10. Портативное устройство считывания пластин

1. Портативное устройство считывания пластин (фиг.8) может быть использовано в качестве альтернативы обычному считывателю^{пластин 24}. Протокол и репрезентативные результаты см.

11. RT-qPCR для обнаружения вируса Зика

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются шаги по выполнению RT-qPCR для обнаружения вируса Зика из образцов пациентов (см. Дополнительный протокол).

1. Чтобы избежать загрязнения, соберите компоненты RT-qPCR в области, изолированной от процесса усиления (например, с чистым капотом). Поместите буфер RT-qPCR, ферменты и праймер/зонды на лед или холодный блок. После этого добавьте реакции к плите из 384 скважин на льду в соответствии с таблицей 9.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательный (контроль извлечения и нешаблонный контроль [NTC]) и положительный контроль (10⁴ PFU/мл) рекомендуются для всех экспериментов.
2. После добавления реагентов в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл перемешайте реакцию путем пипетирования вверх и вниз (не вихрь) и дозируйте 6,5 мкл в каждую лунку. Добавьте 3,5 мкл каждого шаблона РНК в трех экземплярах.
3. Поместите пленку ПЦР поверх пластины. Центрифугировать 384-луночную пластину при 600 х г в течение 2 мин.
4. Поместите пластину в машину RT-qPCR, используя следующие условия циклирования, описанные в таблице 10. Для анализа результатов используйте программное обеспечение для проектирования и анализа машин RT-qPCR и учитывайте автоматический порог и исходный уровень (см. подробную информацию в Дополнительном протоколе).

Компонент	Том	Концентрация
2X QuantiNova Зонд RT-PCR Мастер Микс	5 мкл	1 Х
100 мкМ Прямая грунтовка	0.08 мкл	0,8 мкМ
100 мкМ Обратная грунтовка	0.08 мкл	0,8 мкМ
Зонд 25 мкМ	0.04 мкл	0,1 мкМ
Эталонный краситель QuantiNova ROX	0.05 мкл	1 Х
QuantiNova Зонд RT Микс	0.1 мкл	1 Х
Шаблон РНК	3.5 мкл	-
Вода без нуклеаз	до 10 мкл	-

Таблица 9: Компоненты RT-qPCR для усиления РНК вируса Зика на основе протокола Центров по контролю и профилактике заболеваний CDC США для обнаружения вируса Зика из образцов³¹ пациента.

Шаг		Температура	Время
Обратная транскрипция		45 °С	15 мин
Начальный этап активации ПЦР		95 °С	5 мин
45 циклов	Денатурация	95 °С	5 с
	Комбинированный отжиг/удлинение	60 °С	45 с

Таблица 10: Условия циклического цикла для RT-qPCR.

Результаты

После вычислительного проектирования конструкция трех носочных переключателей была выполнена методом ПЦР. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза агарозного геля (рисунок 2). Наличие четкой полосы около 3000 bp, примерно размером с ген lacZ , связанного с переключением пальцев ног, обычно указывает на успешную реакцию. В качестве альтернативы, полоса без полосы, нескольких полос или полосы неправильного размера указывает на неудачную ПЦР. В случае неудачной ПЦР условия реакции и/или последовательности праймеров должны быть оптимизированы.

Собранные переключатели были экранированы для оценки каждого датчика по его соответствующей транскрибированной in vitro триггерной РНК (рисунок 3). В то время как все три датчика отображали повышенное поглощение OD₅₇₀ , переключатель 27B (рисунок 3A) имел самую быструю скорость включения. Переключатели 33B и, в меньшей степени, 47B показали повышенное поглощение OD₅₇₀ в отсутствие РНК целевого триггера, что указывает на то, что эти переключатели обладают некоторой фоновой активностью или утечкой (рисунок 3B, C) - черта, не желаемая в датчике-кандидате, поскольку она может снизить специфичность. Для более четкой идентификации датчика с наибольшим соотношением сигналов ON/OFF было рассчитано изменение коэффициента поглощения OD₅₇₀ (см. раздел 5 дополнительной информации) и построен график (рисунок 4). Из этого анализа ясно, что переключатель 27B - это датчик, который имеет наилучшую производительность с соотношением ON / OFF около 60.

Затем оценивали чувствительность наиболее эффективного переключателя носочного удержания (27B) путем определения самой низкой концентрации РНК, необходимой для активации переключателя toehold в сочетании с реакцией NASBA. График показывает, что наиболее эффективные датчики Зика могут обнаруживать РНК в концентрациях до 1,24 молекулы на мкл (что эквивалентно ~ 2 аМ; Рисунок 5).

После того, как переключатель 27B был идентифицирован и проверен, материалы датчиков были распределены среди членов команды в Ресифи в штате Пернамбуку в Бразилии. В Бразилии клиническая диагностическая точность диагностической платформы вируса Зика оценивалась с использованием образцов пациентов с вирусом Зика параллельно с RT-qPCR для сравнения. Для проверки бумажной диагностической платформы Zika был использован портативный считыватель пластин, который способен инкубировать и считывать колориметрический выход бумажных датчиков. Изменение цвета с желтого на фиолетовый используется для идентификации положительного образца, в то время как отрицательный образец остается желтым (рисунок 6). Дополнительной опцией для визуализации результатов, генерируемых портативным считывателем пластин (рисунок 8), является построение колориметрического отклика для каждой реакции на бумажной основе с течением времени. Образцы были протестированы в трех экземплярах, а те, которые превысили пороговое значение (красная линия установлена на 1), считались положительными, в то время как образцы ниже порога считались отрицательными (рисунок 6 и рисунок 7).

Наконец, чтобы оценить и сравнить клиническую производительность датчика переключателя Зика с текущим методом золотого стандарта для диагностики вирусной инфекции Зика, все образцы пациентов были протестированы параллельно с RT-qPCR. График амплификации двух репрезентативных образцов пациентов был протестирован в трех экземплярах для обнаружения вируса Зика с помощью RT-qPCR (рисунок 9). Образцы считаются положительными, когда пороговое значение цикла (Ct) составляет ≤38; красная линия указывает на положительный образец, а синяя линия указывает на отрицательный образец на вирус Зика.

Рисунок 2: Электрофорез агарозного геля для оценки качества продуктов ПЦР. Продукты ПЦР анализируют на 1% агарозном геле в 1X TAE, запускают при 80 В в течение 90 мин. Одна четкая полоса обычно указывает на успешную реакцию. Полоса 1: 1 кб ДНК лестницы; Полосы 2-4: 27B переключает ДНК, 33B триггер ДНК и 47B триггер ДНК соответственно. Цифры с левой стороны представляют размер полосы в bp. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Прототип трех носочных переключателей для бумажных датчиков Зика. Производительность трех бумажных датчиков переключателя РНК измерялась при 37 °C в течение более 130 минут. Каждый график содержит две трассировки, одна из которых представляет только элемент управления переключателем, а другая представляет переключатель и триггер. Три графика представляют данные, полученные с помощью датчиков 27B (A), 33B (B) и 47B (C). Полосы ошибок представляют стандартную погрешность среднего значения (SEM) из трех реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Наиболее эффективные датчики идентифицируются путем расчета изменения коэффициента поглощения при 570 нм. Изменение сгиба (или максимальное соотношение ON/OFF) рассчитывается путем измерения соотношения поглощения (OD₅₇₀) через 130 мин между переключателем только управления и переключателем плюс триггер CFPS анализ. Полосы ошибок представляют SEM из трех реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Оценка чувствительности наиболее эффективного переключателя. In vitro транскрибированная РНК Зика титруется в реакции NASBA. После 1-часовой инкубации реакции добавляли к бесклеточным реакциям PURExpress на бумажных дисках в соотношении 1:7. Производится изменение складки через 130 мин при 37 °C. Эта цифра воспроизводится из²⁴. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Портативный считыватель пластин, загруженный захваченными данными изображения. На этом рисунке показан образец окончательного изображения, полученного портативным устройством считывания пластин во время сбора данных. Исходная отметка даты и времени видна в верхней части изображения. Желтый цвет указывает на контроль или отрицательные реакции, а фиолетовый цвет указывает на положительную реакцию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Режим анализа данных. Слева пользователи выбирают наборы данных, которые они хотели бы построить; затем графики отображаются справа с уникальными цветами для каждого образца или набора элементов управления. Пунктирная красная линия служит порогом для определения положительных и отрицательных образцов. Образцы, протестированные в трех экземплярах, которые превышают пороговое значение, считаются положительными, в то время как образцы ниже порога считаются отрицательными. Полосы ошибок представляют стандартное отклонение (SD) от трех реплик. Ctrl 1 - Ctrl 5 указывает на элементы управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8. PLUM, портативный считыватель пластин. Этот портативный считыватель пластин действует как лаборатория в коробке и служит в качестве считывателя пластин с контролируемой температурой для инкубации и мониторинга колориметрических реакций. Это портативное устройство может обеспечить количественные и высокопроизводительные измерения бумажных датчиков Зика на месте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: График RT-qPCR амплификации двух образцов пациентов, протестированных в трех экземплярах для обнаружения вируса Зика. Образцы считаются положительными, когда пороговое значение цикла (Ct) составляет ≤38. Пунктирная красная линия служит порогом для определения положительных и отрицательных образцов. Красный след указывает на положительный образец, а синий след указывает на отрицательный образец. Значение ΔRn (дельта Rn) представляет собой нормализованную величину флуоресцентного сигнала, обнаруженного прибором RT-qPCR для всех тестируемых образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Файл дополнительного протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительные цифры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти рисунки. 

Обсуждение

Комбинированная бумажная система, описанная здесь, может довести клинически значимую молекулярную диагностику с производительностью, функционально сопоставимой с RT-qPCR, до точки необходимости⁶. Важно отметить, что для удаленных настроек доступность диагностики на месте может сократить время получения результатов с дней до нескольких часов. Подчеркивая программируемость этого подхода, описанный конвейер может быть использован для обнаружения практически любой патогенной мишени. Мы объединили молекулярные инструменты со специализированным портативным пластинчатым считывателем, который компактен и совместим с батареей (8–9 ч) и обеспечивает встроенный анализ данных для обеспечения распределенных приложений. В другой работе мы проверили комбинированное оборудование и платформу диагностики вируса Зика с 268 образцами пациентов, параллельно с RT-qPCR, и обнаружили диагностическую точность 98,5%²⁴. В совокупности наша цель состоит в том, чтобы обеспечить передачу технологии этой платформы исследователям, чтобы она могла быть перепрофилирована и улучшена сообществом для удовлетворения неудовлетворенных диагностических потребностей.

Процесс проектирования переключателя in silico toehold был интегрирован и автоматизирован в трубопровод, который можно разделить на три этапа. Первый этап генерирует пул конструкций переключателей, которые гибридизируются с целевой последовательностью с одним нуклеотидным шагом. На втором этапе проверяется вторичная структура и доступность переключателя носков, а также устраняются датчики с внутрирамочными кодонами преждевременной остановки. Затем реализуется функция оценки, которая учитывает несколько факторов (например, уровень дефекта переключателя toehold, доступность переключателя toehold и доступность целевого сайта), чтобы выбрать конструкции коммутатора верхнего носового удержания на основе общих оценок. На заключительном этапе формируется список последовательностей для конструкций переключателей верхнего носка и соответствующих им целевых триггеров. Верхние последовательности датчиков должны быть проверены на специфичность по отношению к транскриптому человека и тесно связанным вирусным геномам с использованием NCBI/Primer-BLAST²⁵. Также рекомендуется проверять целевые участки датчиков для сохранения последовательностей в вирусном геноме вируса Зика, чтобы гарантировать, что датчики обеспечат широкое и надежное обнаружение. Было разработано несколько версий программного обеспечения для проектирования коммутаторов toehold, и алгоритм проектирования позволяет пользователям генерировать две версии, либо коммутаторы серии A⁶, либо коммутаторы серии B⁶. В этой статье основное внимание было уделено дизайну переключателя серии B.

После коммерческого синтеза ДНК переключатели пальцев ног могут быть быстро собраны, а затем протестированы путем выполнения начального скрининга против синтетической последовательности триггера-мишени, которая соответствует коротким областям (200-300 нт) генома-мишени. Для скрининга производительности датчиков на основе переключателя toehold идеально добавить целевую последовательность в виде РНК. В этой статье были описаны шаги, необходимые для добавления транскрибированной in vitro триггерной РНК. Однако, если таковые имеются, можно использовать полноразмерные шаблоны генома, такие как количественные вирусные экстракты РНК или коммерческие синтетические геномы или стандарты РНК. Использование полноразмерных геномов РНК для первоначального скрининга переключения пальцев ног полезно, поскольку оно может сообщить, повлияют ли дополнительные факторы, такие как вторичная структура РНК, на производительность датчика. Чтобы оптимизировать соотношение ON/OFF переключателей-кандидатов, ДНК переключателя носкворка может быть титрована в бесклеточную реакцию. Этот этап также может служить для идентификации высокопроизводительных переключателей носковых удерживающих устройств (сгибающее усиление или высокое соотношение ON/OFF) и пропускать протекающие переключатели носкового удержания (высокий сигнал в отсутствие целевой РНК) с последующих этапов характеризации.

Чтобы улучшить предел обнаружения наиболее эффективных кандидатов на переключение пальцев ног, NASBA используется для повышения клинически значимых концентраций целевой вирусной РНК Зика до уровня, который может быть обнаружен переключателями⁶. Различные комбинации наборов прямых и обратных праймеров проверяются для определения наилучших комбинаций праймера NASBA и переключателя носок, чтобы обеспечить обнаружение клинически значимых концентраций. После того, как идеальная комбинация праймера и переключателя носкреба была идентифицирована, анализ переносится на клиническую проверку. Важно отметить, что этапы переключения носков и скрининга NASBA могут быть трудоемкими и ресурсоемкими, и поэтому разработка тестов лучше всего подходит для хорошо обеспеченных ресурсами исследовательских объектов. Хотя мы не применяли автоматизацию процессов, вполне вероятно, что это может ускорить итеративный цикл проектирования, сборки и тестирования³². К счастью, время обработки от проектирования датчиков и тестирования до развертывания может быть удивительно коротким (менее недели), что делает эту стратегию идеальной для критических по времени ситуаций, таких как эпидемические вспышки⁶.

Даже после того, как был разработан биосенсор с клинически значимой чувствительностью, существуют технические проблемы, которые необходимо решить. Поскольку этот протокол включает в себя ручное управление и является многоэтапной процедурой, существует риск перекрестного загрязнения между образцами. Мы делаем все возможное, чтобы уменьшить этот риск с помощью тщательной лабораторной практики. В недавнем клиническом испытании 268 образцов пациентов мы не столкнулись с какими-либо проблемами загрязнения; однако это важное соображение²⁴. Имея это в виду, протокол остается лабораторным анализом и требует опытного пользователя, владеющего надлежащими методами молекулярной биологии. Дополнительным соображением при развертывании является выделение РНК из образцов пациентов. Здесь мы описываем изоляцию РНК с использованием наборов экстракции нуклеиновых кислот на основе колонн. Однако в других работах мы продемонстрировали эффективный и простой метод кипящего лизиса (95 °C в течение 2 мин) для обработки образцов пациентов с низкой нагрузкой⁶. Эта стратегия почти устраняет затраты, связанные с извлечением РНК, и позволяет избежать использования наборов для экстракции нуклеиновых кислот на основе колонн, которые могут представлять логистическую проблему в условиях ограниченных ресурсов или проблемах цепочки поставок во время кризисов, таких как пандемия COVID-19³³.

Как мы видели во время пандемии COVID-19, инструменты, используемые для выполнения RT-qPCR, сами по себе могут служить узким местом и ограничивать доступ пациентов к тестированию. Этот фактор, который также в значительной степени является финансовым, приводит к централизованному режиму тестирования, который может ограничить диагностический доступ. Например, во время вспышки Зика в 2015/2016 годах в Бразилии было доступно только пять национальных референс-лабораторий, что вызвало задержки в тестировании пациентов. Без учета потенциальной выгоды от эффекта масштаба, текущая стоимость товаров для портативного считывателя пластин составляет ~ 500 долларов США, что, даже если увеличить в пять раз с учетом рабочей силы и коммерческой маржи, по-прежнему обеспечивает доступный инструмент. Это хорошо сопоставимо с инструментами RT-qPCR, стоимость которых варьируется от 15 000 до 90 000^{долларов США 34}. Кроме того, оценочная стоимость одного теста для бесклеточного анализа в Латинской Америке составляет около 5,48 доллара США, в то время как стоимость теста RT-qPCR в Бразилии составляла ~ 10-11 долларов США на момент вспышки Зика³⁶. Помимо стоимости оборудования, портативный считыватель пластин имеет небольшую площадь (20^см3), автоматический анализ, загрузку данных в облако через Интернет и может работать от батареи. Эти функции значительно расширяют потенциальные возможности, в которых может быть развернуто тестирование, и одновременно расширяют популяцию пациентов, которые могут быть обслужены.

На сегодняшний день наиболее распространенными коммерческими платформами E. coli CFPS являются системы S30 и PURE³⁷; однако одним из ключевых факторов улучшения доступа к диагностике в странах с низким и средним уровнем дохода является ограниченность наличия этих реагентов на внутреннем рынке. Важным шагом на пути к решению этой проблемы является развитие местного производства CFPS. Лаборатория Federici недавно добилась значительного прогресса в разработке некоммерческой платформы для реализации датчиков на основе переключателей в бесклеточных системах на основе лизата, достигнув LOD 2,7 fM с РНК¹⁴ вируса Зика. Это достижение не только позволяет производить реагенты в стране использования, избегая импортных тарифов и задержек, но затраты на рабочую силу также масштабируются до местных ставок, и, таким образом, общая стоимость может быть значительно снижена. В работе, изложенной группой Федеричи, стоимость производства реакции экспрессии CFPS (5 мкл) в Чили составила 6,9 центов (USD)^35,38, обеспечивая двойной стимул (улучшенная логистика и стоимость) для внедрения систем на основе лизата ^35,38.

Размещение тестирования, сопоставимого с RT-qPCR, в распределенных диагностических сетях может принести значительные преимущества по сравнению с нынешней практикой, которая зависит от транспортировки образцов на централизованные объекты RT-qPCR. В пригородных условиях, где были сосредоточены случаи Зика, физическое расстояние между пациентом и диагностическим учреждением замедляет диагностику и увеличивает риск того, что результаты не достигнут пациента в клинически значимое время. Мы надеемся, что представленная здесь работа может способствовать тому, чтобы научно-исследовательское сообщество путем передачи знаний могло создать децентрализованные биотехнологии и портативное оборудование для здоровья человека, сельского хозяйства и мониторинга окружающей среды.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
384 well plate covers - aluminum	Sarstedt	95.1995	Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader
384 well plate covers - transparent	Sarstedt	95.1994	Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader
384 well plates	VWR	CA11006-180	2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification
Agarose	BioShop Canada	AGA001.500	Gel electrophoresis
BSA	BioShop Canada	ALB001.500	Blocking agent for the Whatman filter paper
Cell free reactions	New England Biolabs	E6800L	PURExpress
CPRG	Roche	10884308001	Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside
Disposable Sterile Biopsy Punches	Integra Miltex	23233-31	Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate
DNAse I	Thermo Scientific	K2981	Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction
DNAse I Kit	Thermo Scientific	74104	DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA
dNTPs	New England Biolabs	N0446S	Used for PCRs
electrophoresis system	Bio-Rad	1704487	Used to run the agarose gels
Gel imaging station	Bio-Rad	1708265	ChemiDoc XRS+ Imaging System
IVT kit	New England Biolabs	E2040S	Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening
Nanodrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W	Used for determining nucleic acid concentrations
NASBA kit	Life Sciences Advanced Technologies	NWK-1	Isothermal amplification reaction components
Nuclease free H20	invitrogen	10977015	Added to reaction mixes
PAGE electrophoresis system	Biorad	1658001FC	Used to cast and run polyacrylamide gels
pCOLADuet-LacZ DNA	Addgene	75006	https://www.addgene.org/75006/
Phusion polymerase/reactioin buffer	New England Biolabs	M0530L	Used for PCRs
Plate reader	BioTek	BioTek NEO2	Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2
Primers	Integrated DNA Technologies		Custom oligo synthesis
Q5 polymerase/reaction buffer	New England Biolabs	M0491L	Used for PCRs
Qiagen PCR Puriifcation Kit	QIAGEN	27106	QIAprep Spin Miniprep Kit
RNA loading dye	New England Biolabs	B0363S	2X RNA loading dye
RNA Purification Kit	QIAGEN	EN0521	QIAamp Viral RNA extraction kit
RNase inhibitor	New England Biolabs	M0314S	Used to prevent contamination of RNases A, B, and C
RT-qPCR kit	QIAGEN	208352	QuantiNova Probe RT-PCR Kit
SYBR Gold	Invitrogen S11494	S11494	PAGE gel stain for nucleic acids
TAE Buffer	BioShop Canada	TAE222.4	Gel electrophoresis buffer
Thermal Cycler	Applied Biosystems	4484073	Used for temperature cycling and incubating reactions
Whatman 42 filter paper	GE Healthcare	1442-042	Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics