JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Аннотация

Эндотелий представляет собой динамическую интегрированную структуру, которая играет важную роль во многих физиологических функциях, таких как ангиогенез, гемостаз, воспаление и гомеостаз. Эндотелий также играет важную роль в патофизиологии, такой как атеросклероз, гипертония и диабет. Эндотелиальные клетки образуют внутреннюю оболочку кровеносных и лимфатических сосудов и проявляют гетерогенность в структуре и функциях. Различные группы оценивали функциональность эндотелиальных клеток, полученных из периферической крови человека, уделяя особое внимание эндотелиальным клеткам-предшественникам, полученным из гемопоэтических стволовых клеток или зрелых эндотелиальных клеток крови (или эндотелиальных колониеобразующих клеток). Эти клетки обеспечивают аутологичный ресурс для терапии и моделирования заболеваний. Ксеногенные клетки могут обеспечить альтернативный источник терапевтических средств из-за их доступности и однородности, достигаемой с помощью генетически сходных животных, выращенных в аналогичных условиях. Таким образом, был представлен надежный протокол выделения и расширения эндотелиальных клеток с высоким пролиферативным ростом крови из периферической крови свиней. Эти клетки могут быть использованы для многочисленных применений, таких как сердечно-сосудистая тканевая инженерия, клеточная терапия, моделирование заболеваний, скрининг лекарств, изучение биологии эндотелиальных клеток и совместные культуры in vitro для исследования воспалительных и коагуляционных реакций при ксенотрансплантации.

Введение

Эндотелий представляет собой очень сложную, динамичную структуру и жизненно важный компонент сосудистой стенки. Он выстилает внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, обеспечивая физический интерфейс между циркулирующей кровью и окружающими тканями. Известно, что эта гетерогенная структура выполняет различные функции, такие как ангиогенез, воспаление, вазорегуляция и гемостаз 1,2,3,4. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека являются широко изученным типом клеток для оценки функциональности эндотелиальных клеток. Тем не менее, вариабельность партии для конкретного пациента, непоследовательный фенотип и минимальная эффективность расщепления предполагают необходимость определения источника клеток, который мог бы улучшить все эти особенности5.

Получение однородной популяции первичных эндотелиальных клеток может быть технически сложным, а первичные эндотелиальные клетки не обладают высокой пролиферативной способностью6. Следовательно, для изучения регенерации сосудов и оценки патофизиологических процессов различные группы пытались получить и оценить различные типы эндотелиальных клеток, полученных из периферической крови, например, эндотелиальные клетки-предшественники (EPC) или эндотелиальные клетки роста крови (BOEC)6,7,8,9 . Веретенообразные ранние ЭПК происходят из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и имеют ограниченную потенциал роста и ограниченную ангиогенную способность продуцировать зрелые эндотелиальные клетки. Кроме того, они очень похожи на воспалительные моноциты. Кроме того, их способность к дальнейшей дифференцировке в функциональные, пролиферирующие, зрелые эндотелиальные клетки все еще остается спорной 6,7,9,10. Непрерывная культура мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) может привести к образованию вторичной популяции клеток, известных как EPC с поздним ростом, BOEC или эндотелиальные колониеобразующие клетки (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. в 2018 году признали ограничения EPC, неоднозначность их номенклатуры, а также общее отсутствие соответствия со многими различными типами клеток, постоянно группируемыми под EPC11. Напротив, BOEC получили признание за их роль в восстановлении сосудов, здоровье и болезни, а также клеточную терапию. Дальнейшее изучение и терапевтическое использование этих клеток будет основываться на протоколах для последовательного получения этих типов клеток из циркулирующих клеток-предшественников.

Первичные клетки, такие как BOEC, могут быть использованы в качестве суррогата для получения высокопролиферативных зрелых эндотелиальных клеток6. BOEC фенотипически отличаются от ранних EPC и демонстрируют типичные эндотелиальные особенности, такие как морфология булыжника и экспрессия прилипших соединений и кавеол12. Профилирование генов, проведенное Hebbel et al.13,14,15, показало, что BOEC или ECFC являются истинными эндотелиальными клетками, поскольку они способствуют образованию микрососудов и крупных сосудов. Таким образом, BOEC могут быть использованы в качестве инструмента для оценки патофизиологических процессов и генетической изменчивости16. Они также считаются отличным источником клеток для клеточной терапии для регенерации сосудов17. Следовательно, стандартизированный протокол для последовательного получения этих высокопролиферативных клеток имеет важное значение.

В то время как BOEC предоставляют мощный инструмент для изучения патофизиологических и генетических вариаций человека, более однородный источник BOEC может обеспечить более надежные и надежные экспериментальные и терапевтические результаты. Превосходная однородность может быть достигнута за счет использования ксеногенных клеточных источников, полученных от генетически сходных животных, выращенных в аналогичных условиях18. В то время как ксеногенные клеточные источники склонны вызывать иммунный ответ хозяина, разрабатываются стратегии иммуномодуляции с целью получения иммуносовместимых животных и продуктов животного происхождения, включая клетки. Свиньи, в частности, являются обильным источником периферической крови и обычно используются для изучения медицинских устройств и других методов лечения из-за анатомического и физиологического сходства с людьми. Следовательно, это исследование уточняет протокол выделения и распространения высокопролиферативных BOEC из периферической крови свиней. Протокол, подробно описанный ниже, является простым и надежным методом получения большого количества BOEC из относительно небольшого объема крови. Культуры могут быть расширены через несколько проходов для получения миллионов клеток из одного образца крови.

протокол

Все исследования на животных были одобрены соответствующими институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинском колледже Висконсина и клинике Майо.

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались домашние свиньи помеси йоркшир/ландрас/дюрок (Sus domesticus), самцы и самки, 40-80 кг, в возрасте 3-6 месяцев.

1. Забор периферической крови свиней

  1. Подготовьте материалы.
    1. Раствор гепарина развести до 100 ЕД/мл в стерильном физиологическом растворе.
    2. Добавьте по 3-4 мл раствора гепарина в каждую из двух конических пробирок по 50 мл и двух шприцев по 60 мл.
    3. Наберите неразбавленный раствор гепарина (1,000 Ед / мл) в удлинительную трубку.
    4. Подсоедините иглу 19 г к одному концу удлинительной трубки, заполненной гепарином, и шприц, содержащий гепарин, 60 мл к другому концу.
  2. Анестезировать свинью в соответствии с институциональной политикой
    1. Введите внутримышечное введение атропина (0,05 мг / кг), тилетамина / золазепама (2-5 мг / кг) и ксилазина (2 мг / кг), чтобы вызвать анестезию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: адекватная анестезия достигается, когда животное находится без сознания, а мышцы нижней челюсти нежесткие.
    2. Положите животное в положение лежа на спине и положите свернутые полотенца с обеих сторон, чтобы обеспечить устойчивость.
    3. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
    4. Обеспечьте тепловую поддержку во время анестезии, включая одеяла, грелки и/или процедурный стол с подогревом.
  3. Очистите бедренную паховую область раствором скраба бетадина.
  4. Проколите бедренную вену или артерию иглой 19 G и медленно (~ 1-2 мл / с) наберите 50 мл крови в шприц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком быстрое рисование может привести к повреждению ячеек.
  5. Оставив иглу на месте, немедленно перегните удлинительную трубку и отсоедините шприц объемом 60 мл
  6. Медленно переведите кровь в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую гепарин.
  7. Плотно закройте коническую пробирку объемом 50 мл, аккуратно переверните несколько раз, чтобы перемешать, и положите на лед.
  8. Подсоедините оставшийся шприц, содержащий гепарин, объемом 60 мл к удлинительной трубке, разверните удлинительную трубку и медленно наберите в шприц еще 50 мл крови.
  9. Немедленно извлеките иглу из артерии или вены и медленно наберите оставшуюся кровь из удлинительной трубки в шприц.
  10. Отсоедините шприц объемом 60 мл от удлинительной трубки и медленно перенесите кровь в оставшуюся коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую гепарин.
  11. Плотно закройте коническую пробирку объемом 50 мл, аккуратно переверните несколько раз, чтобы перемешать, и положите на лед.
  12. Нанесите прижимной гемостаз на бедренную паховую область свиньи.
  13. Восстановите свинью в соответствии с институциональной политикой. Непрерывно наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине и не вернется в обычное помещение для содержания / питомника.

2. Выделение мононуклеарных клеток

  1. Разбавьте кровь 1:1 фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) в четырех конических пробирках по 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта работа должна быть выполнена в колпаке для клеточных культур с использованием асептической техники, чтобы избежать загрязнения клеточной культуры.
  2. Добавьте 25 мл готового к использованию раствора с градиентом плотности при комнатной температуре в восемь конических пробирок по 50 мл.
  3. Очень медленно пипеткой вводят 25 мл раствора крови/физиологического раствора вдоль внутренней стороны каждого раствора с градиентом плотности, содержащего 50 мл конической трубки, держа пробирку под острым углом к наконечнику пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор крови должен аккуратно наслаиваться поверх раствора градиента плотности и поддерживать четко определенную границу раздела.
  4. Центрифугируйте пробирки в течение 30 мин при 560 x g и комнатной температуре (RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов отключите тормоз центрифуги, если это возможно.
  5. С помощью тонкой пипетки осторожно соберите охристую оболочку (мутный слой мононуклеарных клеток над раствором градиента плотности и ниже прозрачной плазмы) из каждой пробирки и равномерно распределите по двум новым коническим пробиркам объемом 50 мл. Откажитесь от раствора градиента плотности, содержащего трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите как можно больше охристой шерсти, собирая при этом как можно меньше раствора градиента плотности и плазмы.

3. Промывка и обшивка ячеек

  1. Обмажьте 6-луночную пластину фибронектином.
    1. Сделайте исходный раствор фибронектина плазмы человека, разбавив его до 1 мг/мл в стерильной воде. Хранить аликвоты при температуре -20 °C.
    2. Сделайте 3,6 мл рабочего раствора фибронектина, разбавив 600 мкл исходного раствора фибронектина в 3 мл PBS.
    3. Перенесите 600 мкл рабочего раствора фибронектина в каждую лунку 6-луночной пластины и аккуратно откачайте до равномерного покрытия.
    4. Подождите 30 минут, пока фибронектин покроет лунки, и аккуратно аспирируйте раствор из каждой лунки.
  2. Ожидая, пока фибронектин покроется, промойте мононуклеарные клетки
    1. Долейте до 45 мл PBS в пробирки
    2. Центрифуга в течение 5 мин при 560 x g и 4 °C с низким тормозом. Аспирируйте надосадочную жидкость из обеих трубок.
    3. Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 25 мл PBS.
    4. Повторите стирку во второй раз.
  3. Ресуспендируют каждую клеточную гранулу в 5 мл PBS и добавляют 15 мл 0,8% раствора хлорида аммония в каждую пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг заключается в лизиме оставшихся эритроцитов.
  4. Инкубировать на льду 10 мин.
  5. Промойте ячейки, как и раньше, доливая пробирки PBS и центрифугу в течение 5 мин при 560 x g и 4 °C с низким тормозом. Аспирируйте надосадочную жидкость из обеих трубок.
  6. Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 25 мл PBS и повторите промывку во второй раз.
  7. Ресуспендируют каждую клеточную гранулу в 6 мл питательной среды EGM-2 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1x раствора антибиотика / антимикота, содержащего 10 000 ЕД / мл пенициллина, 10 мг / мл стрептомицина и 25 мкг / мл амфотерицина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: питательная среда EGM-2 состоит из питательной среды EBM-2 с добавлением 200 мкл гидрокортизона, 2 мл фактора роста фибробластов человека (hFGF-B), 500 мкл фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), 500 мкл рекомбинантного аналога инсулиноподобного фактора роста (R3 IGF-1), 500 мкл аскорбиновой кислоты, 500 мкл эпидермального фактора роста человека (hEGF), 500 мкл гентамицина/амфотерицина и 500 мкл гепарина на 500 мл.
  8. Аккуратно перенесите 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку 6-луночной пластины, покрытой фибронектином, и осторожно покачайте до равномерного покрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы засеять как можно больше клеток, чтобы максимизировать количество эндотелиальных колоний, которые будут формироваться.

4. Клеточная культура

  1. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO2 и 100% влажности.
  2. На следующий день аккуратно добавьте в каждую лунку по 1 мл свежей питательной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: важно быть осторожным, чтобы не нарушить клетки, которые слабо прилипли к фибронектиновому покрытию.
  3. На следующий день проведите половину смены питательной среды, осторожно отсасывая по 1,5 мл питательной среды из каждой лунки и заменяя ее 1,5 мл свежей питательной среды.
  4. В каждый из следующих 5 дней аккуратно выполняйте полную смену питательной среды в каждую лунку (2 мл свежей питательной среды на лунку).
  5. После этого аккуратно меняйте культуральную среду трижды в неделю.
  6. Регулярно визуализируйте клеточные культуры под микроскопией с низким энергопотреблением (4-кратный объектив).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии эндотелиальных клеток с прилипшим кроветворным ростом (BOEC) начнут появляться в лунках через 7-10 дней после покрытия. Неадгезивные типы клеток будут отбрасываться с изменениями среды, а другие адгезивные типы клеток будут постепенно рассеиваться по мере роста колоний BOEC.
  7. Поместите BOEC в колбу T-75, покрытую фибронектином, когда ~ 70% -80% сливаются, и продолжайте менять питательную среду три раза в неделю.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность посева можно контролировать, помещая колонии в колбу T25. Последующие пассажи не требуют покрытия фибронектином, а смену питательной среды можно сократить до двух раз в неделю.
  8. Клетки из проходов 1-3 могут быть использованы для экспериментов или перенесены в замораживающую среду и сохранены в жидком азоте для будущего использования.

Результаты

Морфология культивируемых клеток наблюдалась с самого начала культивирования до наблюдения колоний BOEC (рис. 1). Меньшая популяция адгезивных клеток начала прикрепляться к чашкам для культивирования и расти, в то время как неадгезивные клетки удалялись с изменением пит?...

Обсуждение

BOEC являются мощным инструментом, который может быть использован в различных научных и терапевтических подходах 7,8,16. BOEC были использованы для анализа экспрессии гена EC для выяснения ключевых факторов, ответственных за развитие сосуди?...

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность за финансирование со стороны NIH/NHLBI R00 HL129068.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
19 G needleCovidien1188818112
50 mL conical tubesCorning352098
6 well plateBD Falcon353046
60 mL syringesCovidien8881560125
Ammonium chloride solution (0.8%)Stemcell Technologies07850
Antibiotic/antimycotic solution (100x)Gibco15240-062
CentrifugeThermo Scientific75-253-839
EGM-2 culture mediumLonza WalkersvilleCC-3162
Extension tubeHanna Pharmaceutical Supply Co.03382C6227
Fetal bovine serum (FBS)Atlas BiologicalsF-0500-A
Ficoll-Paque 1077Cytiva17144003Density gradient solution
Heparin sodium injection (1,000 units/mL)Pfizer00069-0058-01
Human plasma fibronectinGibco33016-015
IceN/AN/A
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco10010-023
Pipette setEppendorf2231300004
Sterile waterGibco15230-162
Thin pipetteCelltreat Scientific229280

Ссылки

  1. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
  2. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
  3. Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
  4. Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
  5. Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
  6. Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
  7. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
  8. Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
  9. Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
  10. Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
  11. Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
  12. Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
  13. Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
  14. Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
  15. Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
  16. Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
  17. Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
  18. Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
  19. Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
  20. Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
  21. Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
  22. Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
  23. Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
  24. De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
  25. Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
  26. Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
  27. Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
  28. Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
  29. Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
  30. Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
  31. Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
  32. Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. Genetically engineered pigs. Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).
  33. Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
  34. Phelps, C. J., et al. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science. 299 (5605), 411-414 (2003).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE179

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены