JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает осаждение белка на основе растворителей в контролируемых условиях для надежного и быстрого восстановления и очистки образцов протеома перед масс-спектрометрией.

Аннотация

В то время как многочисленные достижения в инструментах масс-спектрометрии (РС) улучшили качественный и количественный анализ протеомов, более надежные интерфейсные подходы к выделению, обогащению и обработке белков перед РС имеют решающее значение для успешной характеристики протеома. Низкое, непоследовательное восстановление белка и остаточные примеси, такие как поверхностно-активные вещества, наносят ущерб анализу РС. Осаждение белка часто считается ненадежным, трудоемким и технически сложным для выполнения по сравнению с другими стратегиями подготовки образцов. Эти проблемы преодолеваются путем использования оптимальных протоколов осаждения белка. Для осаждения ацетона комбинация конкретных солей, контроля температуры, состава растворителя и времени осаждения имеет решающее значение, в то время как эффективность осаждения хлороформа / метанола / воды зависит от надлежащего пипетирования и манипуляции с флаконами. В качестве альтернативы, эти протоколы осаждения оптимизированы и полуавтоматизированы в одноразовом отжимном картридже. В данной работе проиллюстрированы ожидаемые результаты осаждения белка на основе растворителя в традиционном формате и с использованием одноразового двухступенчатого фильтрационного и экстракционного картриджа. Это включает в себя детальную характеристику протеомных смесей с помощью анализа LC-MS/MS снизу вверх. Превосходная производительность рабочих процессов на основе SDS также демонстрируется по сравнению с незагрязненным белком.

Введение

Анализ протеомов с помощью масс-спектрометрии становится все более строгим благодаря повышенной чувствительности, разрешению, скорости сканирования и универсальности современных приборов MS. Достижения РС способствуют повышению эффективности идентификации белка и более точному количественному определению 1,2,3,4,5. С улучшенными приборами MS исследователи требуют соответствующей последовательной стратегии подготовки образцов, способной количественно восстанавливать белки высокой чистоты за минимальное время на всех этапах рабочего процесса 6,7,8,9,10,11 . Чтобы точно отразить протеомный статус биологической системы, белки должны быть выделены из нативной матрицы образца эффективным и непредвзятым образом. С этой целью, включая денатурирующее поверхностно-активное вещество, такое как додецилсульфат натрия (SDS), обеспечивает эффективную экстракцию белка и солюбилизацию12. Тем не менее, SDS сильно препятствует электрораспылению ионизации, вызывая серьезное подавление сигнала MS, если не устранить должным образом13.

Для последующего анализа протеомов доступны различные стратегии истощения SDS, такие как удержание белков над фильтром отсечения молекулярной массы, содержащимся в одноразовых спиновых картриджах 14,15,16. Метод пробоподготовки с помощью фильтра (FASP) является предпочтительным, поскольку он эффективно истощает SDS ниже 10 ppm, способствуя оптимальному РС. Тем не менее, восстановление белка с помощью FASP является переменным, что побудило к исследованию других методов. Хроматографические подходы, которые избирательно захватывают белок (или поверхностно-активное вещество), превратились в различные удобные картриджи или форматы на основе бусин 17,18,19,20,21. Учитывая эти простые и (в идеале) последовательные стратегии очистки белка, классический подход осаждения белка органическими растворителями часто упускается из виду как перспективный подход к выделению белка. В то время как осаждение растворителей успешно истощает SDS ниже критических уровней, восстановление белка является давней проблемой этого подхода. Несколько групп наблюдали смещение восстановления белка, с неприемлемо низким выходом осадков в зависимости от концентрации белка, молекулярной массы и гидрофобности22,23. В связи с разнообразием протоколов осаждения, о которых сообщается в литературе, были разработаны стандартизированные условия осаждения. В 2013 году Crowell et al. впервые сообщили о зависимости ионной силы от эффективности осаждения белков в 80% ацетона24. Было показано, что для всех исследованных белков добавление до 30 мМ хлорида натрия необходимо для максимизации выхода (до 100% восстановления). Совсем недавно Nickerson et al. показали, что сочетание еще более высокой ионной силы (до 100 мМ) с повышенной температурой (20 °C) во время осаждения ацетона давало почти количественное восстановление за 2-5 мин25. Наблюдалось небольшое снижение восстановления низкомолекулярных (LMW) белков. Таким образом, последующий отчет Baghalabadi et al. продемонстрировал успешное восстановление белков и пептидов LMW (≤5 кДа) путем объединения специфических солей, особенно сульфата цинка, с более высоким уровнем органического растворителя (97% ацетона)26.

В то время как совершенствование протокола осаждения обеспечивает более надежную стратегию очистки белка для протеомики на основе MS, успех обычных осадков в значительной степени зависит от пользовательской техники. Основной целью этой работы является представление надежной стратегии осаждения, которая облегчает выделение белковой гранулы из загрязняющего супернатанта. Одноразовый фильтрационный картридж был разработан для устранения пипетирования путем выделения агрегированного белка над пористым мембранным фильтром27 из PTFE. МС-интерферирующие компоненты в супернатанте эффективно удаляются на короткой низкоскоростной стадии центрифугирования. Одноразовый фильтрующий картридж также предлагает сменный картридж SPE, который облегчает последующую очистку образца после рерастворимости и дополнительного переваривания белка перед масс-спектрометрией.

Здесь представлен ряд рекомендуемых рабочих процессов осаждения протеомов, включая модифицированные протоколы ацетона и хлороформа/метанола/воды28 , в обычном (на основе флаконов) и полуавтоматическом формате в одноразовом двухсударственном фильтрационном и экстракционном картридже. Результирующее восстановление белка и эффективность истощения SDS выделены вместе с покрытием протеома LC-MS/MS снизу вверх, чтобы продемонстрировать ожидаемый результат от каждого протокола. Обсуждаются практические преимущества и недостатки, связанные с каждым подходом.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Материальные соображения и предварительная подготовка образцов

  1. Используйте только растворители высокой чистоты (ацетон, хлороформ, метанол) (>99,5%) и химические вещества, свободные от лишней влаги.
  2. Готовят растворы хлорида натрия и сульфата цинка (1 М) в воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Солевые растворы могут храниться неопределенно долго при комнатной температуре, если они не содержат загрязняющих веществ или микробов.
  3. Используйте мельчайший флакон микроцентрифуги из полипропилена (ПП), достаточный для сохранения необходимого объема образца и растворителей для индуцирования осаждения.
  4. Убедитесь, что концентрация SDS в образце, подлежащем осаждению, не превышает 2% (мас./об.). Если SDS выше, разбавьте образец водой.
  5. Обеспечьте концентрацию белка от 0,01 до 10 г/л для оптимальной эффективности осаждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная масса для осадков колеблется в пределах 1-100 мкг белка.
  6. Перед использованием убедитесь, что все растворители и растворы не содержат твердых частиц. Выполните либо стадию фильтрации (<0,5 мкм), либо стадию центрифугирования (10 000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре) для удаления нерастворенных частиц.
  7. Если требуется восстановление дисульфидной связи и алкилирование, проводят эти этапы до осаждения белка. Избыточные восстанавливающие и алкилирующие реагенты будут удалены в процессе осаждения.
  8. Осаждение белков путем выбора и выполнения одного из протоколов (этапы 2, 3, 4 или 5).

2. Быстрое осаждение белка (на основе флакона) с ацетоном

  1. Пипет 90 мкл белка (без твердых частиц) или раствор протеома в микроцентрифужную трубку ПП. Затем добавляют 10 мкл 1 М водного раствора NaCl.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ионная сила экстракта протеома уже превышает 100 мМ, дополнительная соль не требуется.
  2. Пипетка 400 мкл ацетона в образец. Закройте флакон крышкой и осторожно постучите по флакону, чтобы соединить растворители. Энергичное перемешивание не требуется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем белка, соли и ацетона может быть увеличен до тех пор, пока сохраняется относительное соотношение каждого из них.
  3. Дайте флакону инкубироваться при комнатной температуре, без помех, в течение минимум 2 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительные инкубации, в том числе при пониженной температуре (например, обычное осаждение ацетона использует ночное осаждение в морозильной камере), может привести к образованию более крупных (видимых) агрегированных белковых частиц (рис. 1А), которые, как правило, не улучшают общее восстановление белка.
  4. После инкубации поместите образцы в центрифугу, отметив ориентацию флакона. Вращайтесь в течение минимум 2 мин, при 10 000 х г или выше при комнатной температуре.
  5. Открутите флакон и аккуратно декантируйте супернатант, медленно перевернув флакон в контейнер для отходов. Прикоснитесь перевернутым флаконом к бумажному полотенцу, чтобы извлечь остаточный растворитель из флакона.
    ВНИМАНИЕ: Отходы растворителей должны сохраняться и выбрасываться в соответствии с соответствующими протоколами.
  6. Для образцов, содержащих SDS, дозируйте 400 мкл свежего ацетона, стараясь не потревожить гранулу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 2.6 является необязательным.
    1. Немедленно центрифугируют образец (10 000 х г или выше в течение 1 мин при комнатной температуре), помещая флакон в ротор в той же ориентации, что и начальный спин. Декантируйте промывочный растворитель, как описано на этапе 2.5.
  7. Дайте образцу полностью высохнуть с открытой крышкой (~1 мин). Повторите чашечку флакона и приступайте к солюбилизации гранул (этап 6).

3. Осаждение низкомолекулярных (LMW) пептидов (ZnSO4 + ацетон)

  1. Дозировать 54 мкл экстракта протеома во флакон ПП 2 мл, а затем добавить 6 мкл 1 МZnSO4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное восстановление пептидов НМВ (≤5 кДа) достигается путем добавления ацетона к конечным 97% по объему. Предполагая, что флакон ПП объемом 2 мл, максимальный начальный объем образца составляет 54 мкл.
  2. Добавьте 1940 мкл ацетона к конечным 97% по объему. Осторожно покрутите, чтобы перемешать, и дайте спокойно постоять на столешнице в течение минимум 2 минут.
  3. Центрифугу (10 000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре) и удалить надотворное вещество, перевернув флакон, а затем прикоснувшись флаконом к бумажному полотенцу.
  4. Для образцов, содержащих SDS, дозируйте 400 мкл свежего ацетона, стараясь не потревожить гранулу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 3.4 является необязательным.
    1. Немедленно центрифугируйте образец в соответствии с этапом 3.3, помещая флакон в ротор в той же ориентации, что и начальный спин. Декантируйте промывочный растворитель, как описано на этапе 3.3.
  5. Повторно солюбилизируйте полученные сухие гранулы в водном растворителе с коротким вихрем или обработкой ультразвуком (~5 мин).

4. Осаждение белка хлороформом/метанолом/водой (ХМВ)

  1. Дозируйте 100 мкл белка или раствора протеома во флакон PP. Добавьте 400 мкл метанола, а затем 100 мкл хлороформа. На короткое время замыкайте флакон и вихрь, чтобы перемешать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для осадков КТМ предпочтение отдается флаконам объемом 1,5 мл с узким дном (рис. 2А).
    ВНИМАНИЕ: Хлороформный растворитель следует обрабатывать в соответствующей вентиляционной вытяжке. Все растворители, которые контактируют с хлороформом, должны рассматриваться как галогенированные отходы при утилизации.
  2. Быстро дозируйте 300 мкл воды непосредственно в центр флакона. Колпачок флакона. Дайте образцу посидеть на столе без помех в течение 1 минуты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор сразу же появится мутным белым цветом. Избегайте смешивания флакона после добавления воды.
  3. Поместите пробирку из полипропилена в центрифугу и открутите не менее 5 минут (10 000 х г или выше при комнатной температуре).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования образуются два видимых слоя растворителя (верхний слой = метанол/вода; нижний = хлороформ). На границе раздела растворителя образуется твердая белковая гранула (рисунок 2А).
  4. Используя большой (1 мл) наконечник микропипетки и удерживая флакон при ~45°, удалите ~700 мкл растворителя из верхнего слоя с равномерной скоростью.
  5. Используйте меньший (200 мкл) наконечник микропипетки, чтобы продолжить удаление верхнего слоя растворителя из флакона с наклоном ~45°. Пипеткой одним непрерывным движением до тех пор, пока верхний слой растворителя не образует шарик во флаконе.
  6. Добавьте 400 мкл свежего метанола во флакон с образцом, не нарушая гранулу, дозируя растворитель вниз по бокам флакона.
  7. Колпачок флакона. Соедините слои растворителя, осторожно раскачивая флакон, чтобы закрутить растворители вместе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать разрушения гранул. Не вихряйте флакон.
  8. Отмечая ориентацию флакона в роторе, центрифуга в течение минимум 10 мин (10 000 х г при комнатной температуре). Белковая гранула прилипает к дну флакона (рисунок 2В).
  9. Опрокините флакон под углом 45°, гранулу повернуть вниз. Поместите наконечник пипетки вдоль верхнего края флакона и удалите надпоставление кончиком микропипетки объемом 1 мл с медленной, но непрерывной скоростью. Сохраните ~20 мкл растворителя во флаконе.
  10. Промыть белковые гранулы для образцов, содержащих SDS, медленно дозируя 400 мкл свежего метанола. Не вихряйте флакон.
    1. Приступайте непосредственно к центрифугированию (10 000 х г в течение 2 мин при температуре), помещая флакон в ротор с той же ориентацией, что и начальный спин.
  11. Удалите растворитель в соответствии со стадией 4.9. Дайте образцу высохнуть на воздухе в вытяжном шкафу до тех пор, пока остаточный растворитель не испарится.
  12. Проконсультируйтесь с рекомендуемыми процедурами резолюбилизации на этапе 6.

5. Осаждение белка с помощью одноразового фильтрационного картриджа

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый протокол осаждения на основе растворителя, описанный на этапах 2-5, может быть выполнен в двухступенчатом картридже фильтрации и экстракции (см. Таблицу материалов).

  1. С помощью пробки, прикрепленной к верхнему фильтрационному картриджу (фиг.3A), дозируйте желаемый объем экстрагированного протеома, соли и растворителя, как описано в одном из трех вариантов ниже.
    1. (Вариант 1) Для осаждения белка с ацетоном смешайте 90 мкл белка или раствора протеома, 10 мкл 1 M водного NaCl и 400 мкл ацетона. Инкубируйте в течение минимум 2 минут на столешнице.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Видимый осадок будет образовываться для концентрированных белковых образцов (1 г/л) (рисунок 3B).
    2. (Вариант 2) Для осаждения пептидов LMW смешайте 15 мкл образца, 1,5 мкл 1 M ZnSO4 и 485 мкл ацетона. Инкубируйте в течение минимум 2 минут на столешнице.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация соли 90 мМ в водном образце не повлияет на извлечение по сравнению с 100 мМ, рекомендованными на этапе 3.
    3. (Вариант 3) Для осаждения ХМВ добавляют 50 мкл экстракта протеома, 200 мкл метанола и 50 мкл хлороформа. Закройте флакон и ненадолго вихрь соединить.
      1. Быстро дозируйте 150 мкл воды непосредственно в центр флакона. Инкубировать в течение 1 мин на столешнице.
  2. Центрифуга в течение 2 мин при 2 500 х г при комнатной температуре с заглушкой, все еще прикрепленной к фильтрационному картриджу.
  3. Переверните картридж, а затем открутите и извлеките заглушку из основания картриджа.
  4. Поместите фильтрационный картридж в чистый флакон и вернитесь в центрифугу. Отжимать в течение 3 мин при 500 х г при комнатной температуре. Выбросьте проточный растворитель из нижнего флакона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если какой-либо растворитель остается в верхнем фильтрационном картридже, вернитесь в центрифугу и выполните дополнительное отжим.
  5. Промыть белковую гранулу, добавив 400 мкл ацетона в фильтрационный картридж (для осаждения CMW, стадия 5.1.3, добавить 400 мкл метанола).
  6. Центрифуга в течение 3 мин при 500 х г при комнатной температуре или до тех пор, пока в верхнем картридже не останется растворителя.
  7. Повторно солюбилизируйте гранулы осаждения, как описано на этапе 6.

6. Резолюбилизация белковых гранул

  1. Смачивайте мембрану у основания фильтрационного картриджа путем дозирования 2-5 мкл изопропанола непосредственно на мембрану непосредственно перед протоколами рерастворимости, описанными ниже.
  2. Следуйте одному из следующих методов рерастворимости.
    1. (Вариант 1) Добавьте в фильтрационный картридж не менее 20 мкл водного буфера, содержащего ≥2% SDS. Колпачок и вихрь энергично (~1 мин). Альтернативно, ультразвук (>10 мин) для диспергирования белковой гранулы.
      1. Нагревайте образец при 95 °C в течение 5 мин). Повторите этап перемешивания после нагревания.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Нагрузочный буфер геля Laemmli может повторно солюбилизировать белковую гранулу. Однако образцы, содержащие SDS, несовместимы с перевариванием трипсина и обратной фазой LC и MS.
    2. (Вариант 2) Готовят раствор 80% (v/v) муравьиной кислоты в воде. Предварительно отклоняют раствор кислоты (-20 °С), а также фильтрационный картридж, содержащий осажденный белок.
      1. Влить в картридж 50 мкл холодной муравьиной кислоты; колпачок и вихрь в течение 30 с. Вернуть в морозильную камеру (-20 °C) на 10 мин.
      2. Вихрь картриджа снова в течение 30 с. Затем повторите цикл охлаждения и перемешивания еще раз (10 мин, -20 °C, вихрь 30 с).
      3. Добавьте воду в конечные 500 мкл, разбавляя муравьиную кислоту до 8%.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол холодной муравьиной кислоты несовместим с последующим перевариванием трипсина, но совместим с LC-MS.
    3. (Вариант 3) Добавьте 50 мкл свежеприготовленной 8 М мочевины в воду в фильтрационный картридж. Ультразвук в течение 30 мин.
      1. Дайте картриджу высиживаться на столешнице в течение 1 ч (до ночи).
      2. Разбавьте 8 М мочевины минимум в 5 раз водой или соответствующим буфером.
        ПРИМЕЧАНИЕ: После разбавления протокол солюбилизации мочевины совместим с последующим перевариванием трипсина, а также LC-MS.

7. Переваривание белка

  1. Для анализа РС снизу вверх подвергайте повторно солюбилизированные белки ферментативному перевариванию с использованием одного из двух методов, упомянутых ниже.
    1. (Вариант 1) Для резолюбилизации муравьиной кислоты уменьшают начальный объем 80% муравьиной кислоты на стадии 6.2.2.1 до 25 мкл. На этапе 6.2.2.3 использовать 375 мкл воды для разбавления муравьиной кислоты до 5% (v/v).
    2. Дозируйте пепсин в картридж при приблизительном соотношении белка к ферменту 50:1. С помощью пробки, прикрепленной к фильтрационному картриджу, инкубируйте образец в течение ночи при комнатной температуре.
  2. (Вариант 2) Для рерастворимости в мочевине обеспечивают рН от 8 до 8,3 с включением 100 мМ tris или бикарбоната аммония на этапе 6.2.3.2.
    1. Добавляют трипсин при приблизительном соотношении массы белка к ферменту 50:1. С помощью пробки, прикрепленной к картриджу, инкубируйте образец в течение ночи на теплой водяной бане при 37 °C.
    2. Прекращают пищеварение путем подкисления раствора 10% TFA до конечного 1%.
  3. Восстановите переваренный пепсином или трипсином белок, сняв пробку с основания фильтра и центрифугируя картридж, содержащийся в чистом флаконе (2 мин, 5000 х г, комнатная температура).

8. Очистка SPE

ПРИМЕЧАНИЕ: Для дополнительного обессоливания образца после сбраживания или обмена растворителем образец может быть подвергнут очистке в обратной фазе, как описано.

  1. Заправляйте картридж SPE (см. Таблицу материалов), пропуская 300 мкл метанола (2 мин, 400 х г) с последующим 300 мкл 5% ацетонитрила/0,1% ТФА (2 мин, 400 х г).
  2. Подключите загрунтованный картридж SPE к основанию фильтрационного картриджа, содержащего повторно солюбилизированный или переваренный белок.
  3. Раскрутите белок через картридж SPE (5 мин, 800 х г при комнатной температуре). Если растворитель остается в верхнем картридже, верните картридж в центрифугу и повторите вращение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное прохождение образца через картридж SPE может улучшить восстановление.
  4. Добавьте 300 мкл 5% ацетонитрила/0,1% TFA в воде в картридж. Для промывки проведите через картридж SPE (2 мин, 2000 х г). Отбросьте сквозной поток.
  5. Для белков LMW или переваренных пептидов элюируют образец путем протекания 300 мкл 50% ацетонитрила / 0,1% TFA (5 мин, 2500 х г).
  6. Для интактных белков следуйте шагу 8.5 с дополнительной стадией элюирования с использованием 300 мкл 75% ацетонитрила / 0,1% TFA. Смешайте два полученных экстракта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 8.6 является необязательным.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 4 обобщено ожидаемое истощение SDS после осаждения белков на основе флакона или картриджа в одноразовый фильтрующий картридж с использованием ацетона. Обычная ночная инкубация (-20 °C) в ацетоне сравнивается с протоколом быстрого осаждения ацетона при комнатно?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Оптимальная характеристика МС достигается при истощении остаточного СДС ниже 10 ppm. В то время как альтернативные подходы, такие как FASP и переваривание на шариках, предлагают количественное истощение SDS с переменным извлечением 31,32,33, основной целью ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Лаборатория Doucette разработала и запатентовала ProTrap XG, используемый в этом исследовании. AAD также является партнером-основателем Proteoform Scientific, которая коммерциализировала картридж для подготовки образцов.

Благодарности

Эта работа финансировалась Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады. Авторы благодарят Bioinformatics Solutions Inc. (Ватерлоо, Канада) и SPARC BioCentre (молекулярный анализ) в больнице для больных детей (Торонто, Канада) за их вклад в сбор данных о РС.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneFisher ScientificAC177170010≤0.002 % aldehyde
AcetonitrileFisher ScientificA998-4HPLC grade
Ammonium BicarbonateMillipore SigmaA6141-1KGsolid
Beta mercaptoethanolMillipore SigmaM3148-25MLMolecular biology grade
Bromophenol blueMillipore SigmaB8026-5GBromophenol blue sodium salt
ChloroformFisher ScientificC298-400Chloroform
Formic AcidHoneywell56302Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass SpectrometerThermoFisher Scientificfor analysis of standard protein mixture
GlycerolMillipore Sigma356352-1L-MFor molecular biology, > 99%
IsopropanolFisher ScientificA4641HPLC grade
MethanolFisher ScientificA452SK-4HPLC grade
MicrocentrifugeFisher Scientific75-400-102up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)Fisher Scientific05-408-130tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL)Fisher Scientific02-681-321rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL)Fisher Scientific21-197-28Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL)Fisher Scientific07-200-302Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL)Fisher Scientific07-200-303Universal pipet tip, non-sterile
MicropipettesFisher Scientific13-710-903Micropipet Trio pack
PepsinMillipore SigmaP0525000Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XGProteoform ScientificPXG-000250 complete units per box
Sodium ChlorideMillipore SigmaS9888-1KGACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl SulfateThermoFisher Scientific28312powdered solid
timsTOF Pro Mass SpectrometerBrukerfor analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic AcidThermoFisher ScientificL06374.AP99%
TrisFisher ScientificBP152-500Molecular biology grade
TrypsinMillipore Sigma9002-07-7From bovine pancreas, TPCK-treated
UreaBio-Rad1610731solid
Water (deionized)Sartorius Arium Mini Water Purification System76307-662Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc SulfateMillipore Sigma307491-100Gsolid

Ссылки

  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318(2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856(2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524(2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051(2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757(2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, at http://www.jstor.org/stable/2529486 768(1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983(2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены