Атомно-силовая микроскопия для изучения физических свойств эпидермальных клеток живых корней арабидопсиса

Резюме

Протокол отступа атомно-силовой микроскопии дает возможность препарировать роль физических свойств клеточной стенки конкретной клетки ткани или органа во время нормального или ограниченного роста (т.е. при дефиците воды).

Аннотация

Здесь описан способ охарактеризовать физические свойства клеточной стенки эпидермальных клеток живых корней арабидопсиса посредством наноиндентов с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) в сочетании с оптическим инвертированным флуоресцентным микроскопом. Метод заключается в приложении контролируемых сил к образцу при измерении его деформации, что позволяет количественно оценить такие параметры, как кажущийся модуль Юнга клеточных стенок при субклеточных разрешениях. Это требует тщательной механической иммобилизации образца и правильного подбора инденторов и глубин углублений. Хотя он может быть использован только во внешних тканях, этот метод позволяет охарактеризовать механические изменения клеточных стенок растений во время развития и позволяет соотнести эти микроскопические изменения с ростом целого органа.

Введение

Растительные клетки окружены клеточной стенкой, которая представляет собой сложную структуру, состоящую из взаимодействующих сетей полисахаридов, белков, метаболитов и воды, толщина которой варьируется от 0,1 до нескольких мкм в зависимости от типа клетки и фазы роста ^1,2. Механические свойства клеточной стенки играют существенную роль в росте растений. Низкие значения жесткости клеточной стенки были предложены в качестве предварительного условия для роста клеток и расширения клеточной стенки, и появляется все больше доказательств того, что все клетки ощущают механические силы для выполнения своих функций. Тем....

протокол

1. Подготовка растительного материала и условий роста

1. Чтобы получить необходимый растительный материал, стерилизуйте семена арабидопсиса дикого типа и мутантные линии, представляющие интерес.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы использовали следующее: ttl1: линии вставки T-ДНК Salk_063943 (для TTL1; AT1G53300) — Колумбия-0 (Col-0) дикого типа; мутант Procuste1 (prc1-1), который состоит из нокаутирующей мутации (Q720stop) в гене CESA6 (AT5G64740), как описано ранее в^10,11; и ttl1 x prc1-1 двойной мутант.
   1. Поместите приблизител....

Результаты

Эксперименты по силовому отступу
В следующем тексте представлены некоторые результаты, ожидаемые при проведении эксперимента с принудительным отступом, чтобы показать типичный выход, ожидаемый при хорошем выполнении протокола.

Кривые силы-смещения

Обсуждение

Механика клеток и клеточных стенок становится все более актуальной, чтобы получить представление о том, как механика влияет на процессы роста. Поскольку физические силы распространяются на значительные расстояния в твердых тканях, изучение изменений физических свойств клеточной сте?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS)			Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells.
AFM software	Bruker, Billerica, MA, USA
Atomic force microscopy (AFM)	BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA
Catalyst Probe holder-fluid	Bruker, Billerica, MA, USA	CAT-FCH	A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode.  Also compatible with air operation.
Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030	Gonotech, Berlin, Germany
Murashige & Skoog Medium	Duchess Biochemie	M0221	Original concentration, (1962)
Optical inverted microscope coupled to the AFM	Olympus IX81, Miami, FL, USA
PEGAMIL	ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina	100429	Neutral, non acidic silicone glue
Petri dishes	Deltalab	200201.B	Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile.
Propidium iodide	Sigma	P4170	For root viability test.
Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A	Bruker, Billerica, MA, USA	DNP-10/A	For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever,  with a spring constant of 0.35 N/m.
Tweezers	Sigma	T4537