Биореактор с визуальным контролем для создания биоинженерной ткани дыхательных путей

Резюме

Протокол описывает биореактор с поддержкой визуализации, который позволяет селективно удалять эндогенный эпителий из трахеи крыс и гомогенное распределение экзогенных клеток на поверхности просвета с последующим долгосрочным посевом in vitro клеточно-тканевой конструкции.

Аннотация

Повторное повреждение тканей дыхательных путей может ухудшить функцию легких и вызвать хроническое заболевание легких, такое как хроническая обструктивная болезнь легких. Достижения в области регенеративной медицины и технологий биореакторов предлагают возможности для производства выращенных в лаборатории функциональных тканей и структур органов, которые могут быть использованы для скрининга лекарств, моделирования заболеваний и инженерных замен тканей. Здесь описан миниатюрный биореактор в сочетании с модальностью визуализации, которая позволяет in situ визуализировать внутренний просвет эксплантированной трахеи крысы во время манипуляций с тканями in vitro и культивирования. Используя этот биореактор, протокол демонстрирует селективное удаление эндогенных клеточных компонентов с помощью визуализации при сохранении внутренних биохимических особенностей и ультраструктуры тканевого матрикса дыхательных путей. Кроме того, показаны доставка, равномерное распределение и последующая длительная культивирование экзогенных клеток на децеллюляризированном просвете дыхательных путей с оптическим мониторингом in situ . Результаты подчеркивают, что биореактор под визуальным контролем потенциально может быть использован для облегчения генерации функциональных тканей дыхательных путей in vitro .

Введение

Просветная поверхность дыхательных путей выстлана слоем эпителия, который в основном состоит из мультиреснитильных, клубных, бокаловидных и базальных стволовых клеток ^1,2. Эпителиальный слой служит основным защитным механизмом легкого, действуя как биофизический барьер, который защищает подлежащую ткань дыхательных путей от вдыхаемых патогенов, частиц или химических газов. Он защищает ткань дыхательных путей с помощью нескольких механизмов, включая образование межклеточных плотных соединений, мукоцилиарный клиренс и антимикробную и антиоксидантную секрецию ^3,4

протокол

Приведенный ниже протокол по тканям животных был одобрен руководством по благополучию животных и правилами Комитета по уходу и использованию животных (IACUC) в Технологическом институте Стивенса и соответствует руководящим принципам Национального института здравоохранения (NIH) по использованию экспериментальных животных.

1. Проектирование и конструирование биореактора трахеи крыс с визуальным контролем

1. Проектирование и изготовление биореактора трахеи крыс
   1. Создайте модель автоматизированного проектирования (CAD) камеры биореактора с соответствующей конструкцией, такой как входные отверстия, выпускные отвер....

Результаты

Метод визуализации in situ на основе линзЫ GRIN может позволить визуализацию внутреннего просвета трахеи in situ (рисунок 5A). С помощью этого метода визуализации можно получить как ярко-полевые, так и флуоресцентные изображения нативной и деэпителизированной трахеи (<.......

Обсуждение

В этой работе мы создали биореактор с визуальным контролем, который может позволить (i) мониторинг просвета трахеи in situ после удаления клеток и доставки экзогенных клеток и (ii) долгосрочную культуру in vitro ткани трахеи, засеянной клетками. Используя этот специально разработанны?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10-010-031
3-port connector	World Precision Instruments	14048-20
4-port connector	World Precision Instruments	14047-10
Accelerometer	STMicroelectronics	IIS3DWBTR
Achromatic doublet	Thorlabs	AC254-150-A-ML
Aluminum pin stub	TED PELLA	16111
Antibiotic-antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062
Assembly rod	Thorlabs	ER1
Button head screws	McMaster-Carr	91255A274
Cage cube	Thorlabs	C4W
Carbon double-sided conductive tape	TED PELLA	16073
CFSE labelling kit	Abcam	ab113853
Citrisolv (clearing agent)	Decon	1061
C-mount adapter	Thorlabs	SM1A9
Collagen I	Advanced BioMatrix	5153
Conductive liquid silver paint	TED PELLA	16034
Dichroic mirror	Semrock	DI03-R488	Reflected laser wavelengths:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11965118
Female luer bulkhead to hose barb adapter	Cole-Parmer	EW-45501-30
Female luer to tubing barb	Cole-Parmer	EW-45508-03
Female to male luer connector	Cole-Parmer	ZY-45508-80
Fetal bovine serum	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10082147
Filter lens	Chroma Technology Corp	ET535/50m
Fluorescent microscope	Nikon	Eclipse E1000 - D
Fusion 360	Autodesk
Hex nut	McMaster-Carr	91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Fisher Scientifc	AC120585000
Imaging fiber	SELFOC, NSG group	GRIN lens
Laser	Opto Engine	MDL-D-488-150mW
Lens tubes	Thorlabs	SM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	L3224
MACH 3 CNC Control Software	Newfangled Solutions
Objective lens	Olympus	UCPLFLN20X
Peristaltic Pump	Cole Parmer	L/S standard digital pump system
Recombinant human FGF-basic	PeproTech	100-18B
Retaining ring	Thorlabs	SM1RR
Scientific CMOS camera	PCO Panda	PCO Panda 4.2
Sodium dodecyl sulfate	VWR	97064-472
Solidworks (2019)	Dassault Systèmes
Stackable lens tube	Thorlabs	SM1L10
Subwoofer plate amplifier	Dayton Audio	SPA250DSP
Subwoofer speaker	Dayton Audio	RSS21OHO-4	Diaphragm diameter: 21 cm
Syringe Pump	World Precision Instruments	AL-4000
Threaded cage plate	Thorlabs	CP33
Threaded luer adapter	Cole-Parmer	EW-45513-81
Tube lens	Thorlabs	AC254-150-A-ML
Tygon Tubing	Cole-Parmer	13-200-110
XY Translator	Thorlabs	CXY1