Безпламенный метод стерилизации C. elegans Picks, Spatulas и Scalpels

Резюме

В этой статье описывается метод стерилизации червячных отрубей, шпателей и скальпелей с использованием микроинсинератора вместо открытого огня.

Аннотация

Caenorhabtidis elegans (C. elegans) является оптимальным модельным организмом для исследований и образования в первую очередь в высших учебных заведениях. Студенты могут быстро освоить стерильную технику, необходимую для поддержания культур C. elegans . Стерилизация платиновых отмычек, используемых для переноса червей с одной пластины на другую, традиционно выполняется путем удержания кирки в пламени от горелки Бунзена или этанолового фонаря. Однако горелки Бунзена требуют источника газа, и оба элемента оборудования представляют риск случайного пожара, связанного с открытым пламенем. Здесь показана методика стерилизации червячных кирок, шпателей и скальпелей с использованием инфракрасного бактериологического петлевого микросинератора. Это оборудование требует только электрической розетки и минимизирует потенциальную опасность пожара. Снижая требования к риску и газу, этот метод хорошо подходит для исследований и преподавания в условиях бакалавриата.

Введение

Модельный организм C. elegans хорошо подходит как для исследований, так и для образования в преимущественно бакалаврских учреждениях (PUI) благодаря низкой стоимости, простоте обслуживания и диапазону применения 1,2,3,4. Для того чтобы обращаться с червями — например, перемещать червя с одной тарелки на другую, экспериментаторы могут использовать червячную кирку. Различные кирки могут быть сделаны или приобретены для использования с C. elegans. Кирки чаще всего изготавливаются с использованием платинового или платинового / иридиевого наконечника, установленного в стеклянной, металлической или деревянной ручке. Стеклянные ручки могут быть изготовлены собственными силами путем плавления пипетки Пастера вокруг платиновой проволоки до тех пор, пока проволока не станет надежной. Дополнительную информацию о разведении C. elegans, в том числе о том, как выращивать и поддерживать червей и их источники пищи, можно найти в WormBook⁵ и других источниках ^6,7,8.

При работе с C. elegans обычно используются асептические методы для предотвращения загрязнения микробами и грибами. Примеры асептических методов включают стерилизацию инструментов, автоклавирование реагентов и проведение работ в стерильных полях. Червячные кирки обычно стерилизуют с использованием открытого^{огня 9}. Кроме того, стерилизация червячной кирки сжигает червей, тем самым предотвращая случайное смешивание штаммов при работе с несколькими штаммами червей. Типичные методы стерилизации червячных отборов включают открытое пламя от горелки Бунзена, этанолового фонаря или стандартной зажигалки (таблица 1). Мы были мотивированы искать более безопасные альтернативы существующим методам в лаборатории, когда студент бакалавриата неосознанно пролил этанол, заполняя этаноловый фонарь, и случайно начал небольшой пожар при зажигании фонаря. К сожалению, было зарегистрировано много несчастных случаев с использованием этаноловых фонарей 10,11,12. К счастью, альтернативные методы стерилизации были проверены для использования в микробиологии, и цель этой статьи - продемонстрировать, как использовать это оборудование для стерилизации инструментов для использования с C. elegans.

В микробиологических лабораториях асептический метод также имеет решающее значение. Серологические петли и провода из платины стерилизуются либо с использованием открытого^{огня 13}, либо микросинератора 14,15,16. Другие названия микросинераторов включают микростерилизаторы или бакто-мусоросжигательные заводы. Преимущества микроинсинератора перед традиционными методами пламени включают снижение пожароопасности, устранение разбрызгивания сжигаемых материалов и возможность работы в ламинарной вытяжке /шкафу биобезопасности 16,17,18. Фактически, как Американское общество микробиологии, так и Всемирная организация здравоохранения рекомендуют использовать микросинераторы вместо использования открытого^огня 17,19,20. По сравнению с горелками Бунзена, микросинераторы также не требуют газовой магистрали, которой некоторые лаборатории могут не иметь или не иметь на каждой скамейке для использования студентами. Вдохновленный этими преимуществами, был разработан протокол для замены использования пламени микро-мусоросжигательными установками для стерилизации широко используемых инструментов, таких как кирки, шпатели и скальпели в лаборатории C. elegans. Этот метод может быть подходящим для инструкторов и исследователей, стремящихся повысить безопасность и / или гибкость при работе с C. elegans.

протокол

1. Подготовьте микроинсинератор

1. Прикрепите к микроинсинератору направляющую держателя петли, прикрепив ее к внешнему стволу.
2. Подключите микроужигательный завод к стандартной электрической розетке 120 В или 230 В в зависимости от обстоятельств.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать на столешнице или в ламинарной вытяжке.
3. Поверните микроинсинератор на высокую настройку и дайте ему прогреться в течение 10-20 минут в зависимости от инструкции производителя для достижения оптимальной температуры 800-825oC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При удержании мусоросжигательного завода включенным более 3 ч, более низкая температура (500 ^oC) может использоваться в качестве резервной настройки. Согласно руководствам производителя, это продлевает срок службы оборудования.

2. Стерилизуйте кирку, шпатель или скальпель

1. Вставьте инструмент в цилиндрическую зону стерилизации, не касаясь боковых сторон, скользя по направляющей²¹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При стерилизации скальпеля очень важно избегать прикосновения лезвия к керамической стенке. Соскабливание керамической стены может поставить под угрозу целостность нагревательного блока.
2. Держите инструмент в зоне стерилизации в течение 5-7 с.
3. Извлеките инструмент, не касаясь боковых сторон, скользя назад вдоль направляющей.
4. Для отмычек дайте инструменту остыть в течение 3-5 с, прежде чем коснуться червя, чтобы избежать его сжигания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скальпели или шпатели, которым не дают остыть, будут петь агар.
5. После сбора червей повторно вставьте кирку в камеру на 5-7 с, чтобы сжечь червей на кирке.

3. Сравнительный метод - стерилизация инструментов с помощью горелки Бунзена

1. Подключите горелку Бунзена к газовой магистрали с помощью резиновых трубок. Убедитесь, что трубка плотно закреплена и расположена горелка подальше от надземных предметов.
2. Включите газ, повернув ручку на газопроводе.
3. Воспламените горелку с помощью ударника или зажигалки.
4. Отрегулируйте пламя с помощью газовой ручки и воздухозаборника, пока не будет виден синий конус.
5. Держите кирку, шпатель или скальпель в пламени, пока он не загорится красным.
6. Для отмычек дайте инструменту остыть в течение 3-5 секунд, прежде чем коснуться червя, чтобы избежать его сжигания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скальпели или шпатели, которым не дают остыть, будут петь агар.
7. После сбора червей снова вставьте кирку в пламя, чтобы сжечь червей на кирке.

4. Эксперимент

1. Культура OP50 Бактерии Escherichia coli (E. coli) в бульоне Лурия²² на ночь на шейкере ^37oC.
2. После ночной культуры разводят культуру в стерильной воде в соотношении 1:100.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот коэффициент разбавления был выбран для обеспечения разделения колоний после нанесения покрытия.
3. Окуните червячную кирку, стерилизованную с помощью горелки Бунзена, в бактериальный раствор, повторно стерилизуйте горелкой Бунзена и закрутите ее в 100 мл стерильной воды.
4. Нанесите 100 мкл воды на чашку Петри 10 см LB agar ^22,23, распределите воду с помощью стерильного разбрасывателя клеток и высиживайте при комнатной температуре в течение 24 ч с крышкой.
5. Выполните шаги 4.3-4.4 с помощью червячной кирки, стерилизованной с помощью микросинератора.
6. В качестве положительного контроля выполняют шаги 4.3-4.4 без повторной стерилизации.
7. В качестве отрицательного контроля выполняют шаги 4.3-4.4, используя стерильную воду вместо бактериального раствора.
8. Подсчитывайте колонии вручную после инкубационного периода.

Результаты

Был разработан простой эксперимент (раздел 4) для демонстрации относительной скорости загрязнения с использованием микросинератора по сравнению с пламенем (рисунок 1, таблица 2). Хотя эти результаты отражают уровень загрязнения между методами, нет необходимости повторять этот метод для использования метода микросинератора. Эксперимент проводился в трех экземплярах. Отрицательным контролем была стерильная вода без бактерий. Положительный контроль не использовал ни один метод стерилизации: кирку опускали в разбавленную культуру OP50, а затем переносили непосредственно в стерильную воду. Все реплики и условия выполнялись параллельно в один и тот же день. Во всех трех отрицательных контрольных пластинах были подсчитаны нулевые колонии. Среднее количество 4,7 (± 0,3 SEM) колоний было получено, когда горелка Бунзена использовалась для стерилизации кирк. Среднее количество 3,3 (±1,2 SEM) колоний наблюдалось в состоянии микросинератора. Тем не менее, среднее количество 298,3 (±17,9 SEM) колоний было получено в положительном контрольном состоянии. 2-хвостовой t-тест, предполагающий равную дисперсию при сравнении горелки Бунзена с микросинератором, не дал статистически значимой разницы, p = 0,35. Таким образом, микроинсинератор достиг результатов стерильности, одинаково эффективных для горелки Бунзена.

Рисунок 1: Количество бактерий в методах стерилизации. Кирки обмакивали в культуру 1:100 OP50 в стерильную воду, а затем стерилизовали с помощью горелки Бунзена или микросинератора. Затем кирки опускали в стерильную воду, покрывали агаром LB ^22,23 и инкубировали в течение 24 ч при комнатной температуре, а колонии подсчитывали вручную. Положительный контроль не имел стерилизации, а отрицательный контроль использовал стерильную воду без бактерий. n = 3 реплики на условие. Примечание: ось Y сломана, чтобы обеспечить разделение точек данных в соответствующих частях графика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Метод стерилизации	Стоить	Лабораторные требования	Преимущества		Недостатки
Микросинератор	$365–530	Розетка 120 В или 230 В	• Портативный • Отсутствие открытого пламени или открытого нагревательного элемента • Возможность использования в ламинарных вытяжках и шкафах биологической безопасности		• Время прогрева • Более высокая стоимость
Горелка Бунзена	$24–169	Газопровод	• Быстрая настройка • Низкая стоимость		• Открытое пламя • Не рекомендуется для использования в ламинарной вытяжке или шкафу биологической безопасности
Этаноловая лампа	$11	Никакой	• Быстрая настройка • Низкая стоимость • Многоразовый		• Открытое пламя • Угроза безопасности при заправке • Не рекомендуется для использования в ламинарной вытяжке или шкафу биологической безопасности • Не допускается в некоторые учреждения
Зажигалка	$5–8	Никакой	• Низкая стоимость • Доступность • Одноразовые • Многоразовый		• Открытое пламя • Ручное управление • Не рекомендуется для использования в ламинарной вытяжке или шкафу биологической безопасности

Таблица 1: Сравнение методов стерилизации инструментов. Четыре метода стерилизации инструментов сравнивались на основе преимуществ, недостатков, затрат и лабораторных требований.

Повторять	Состояние
	Микросинератор	Горелка Бунзена	Отрицательный контроль	Positve Control
1	1	5	0	278
2	4	4	0	334
3	5	5	0	283
Значить	3.3	4.7	0.0	298.3
СЕМ	1.2	0.3	0.0	17.9

Таблица 2: Необработанные данные о количестве бактерий в различных методах стерилизации. Кирки обмакивали в культуру 1:100 OP50 в стерильную воду, а затем стерилизовали с помощью горелки Бунзена или микросинератора. Затем кирки опускали в стерильную воду, покрывали агаром LB ^22,23 и инкубировали в течение 24 ч при комнатной температуре, а колонии подсчитывали вручную. Положительный контроль не имел стерилизации, а отрицательный контроль использовал стерильную воду без бактерий. n = 3 реплики на условие. Среднее значение и SEM, сообщенные ниже индивидуальных подсчетов.

Обсуждение

C. elegans является модельным организмом, хорошо подходящим для упражнений в учебных лабораториях бакалавриата. Использование микросинераторов вместо открытого огня обеспечивает преимущества как в исследовательских лабораториях, так и в аудиторных лабораториях. Фактически, лабораторные курсы бакалавриата могут представлять более высокий риск случайных пожаров, учитывая количество недавно обученных ученых в комнате. Кроме того, риск возгорания возрастает, когда этанол используется для стерилизации инструментов вблизи источника пламени, поскольку пары этанола воспламеняются. Портативность также дает преимущество для классных комнат, где газовые линии не установлены на каждой скамейке. Этот метод использовался в учебных и исследовательских лабораториях нашего учреждения, что привело к отсутствию увеличения загрязнения и нулевым несчастным случаям в лабораторных условиях с момента его создания в 2016 году.

Для обеспечения совместимости с микроинсинераторами был протестирован ряд отмычек с различными креплениями, составами проволоки и проволочными датчиками. В состав проволоки входило 100% платина, а также 90% платина/10% иридий с толщиной проволоки 30-32 Г, и независимо от толщины и состава, способ нагрева не ставил под угрозу целостность проволоки. Крепления включали в себя два различных типа коммерчески доступных ручек и стеклянные крепления собственного производства от пипеток Pasteur. Обратите внимание, что кирки не светятся раскаленными, как в пламени. Тем не менее, достаточная стерилизация все еще достигается до тех пор, пока стерилизатор достигает надлежащей температуры. Таким образом, крайне важно дать микроинсинератору прогреться в течение 10 или 20 минут, как указано в инструкции производителя. Хранение инструмента в камере в течение не менее 5 с для достижения стерилизации также имеет решающее значение. Оставление инструмента в камере дольше 7 с не причинит вреда инструменту, но не является необходимым. Хотя это относительно простая процедура с минимальными шагами и вряд ли потребует устранения неполадок, может потребоваться некоторая практика, чтобы научиться устанавливать инструмент в стволе, не касаясь сторон.

Чтобы заменить открытое пламя, метод стерилизации должен охватывать все приложения, используемые в лаборатории. В дополнение к стерилизующим инструментам, лаборатории C. elegans могут также использовать горелки Бунзена для создания стерильного поля для выполнения других задач, таких как заливка пластин или инокуляция культур¹³. Однако вопрос о том, создает ли это стерильное поле или втягивает все еще жизнеспособные загрязняющие вещества, остается спорным¹⁴. Хотя это не вариант во всех учреждениях, для этих целей можно использовать шкаф биобезопасности или ламинарный вытяжку, что позволяет лаборатории функционировать без использования открытого огня. Инструкции по эксплуатации для большинства микроинсинераторов рекомендуют не использовать для стерилизации лезвий скальпеля, поскольку соскоб внутренних стенок повреждает стерилизатор. Однако при осторожном использовании направляющей можно стерилизовать лезвие скальпеля или шпатель, не касаясь внутренних стенок. Это расширяет использование метода, позволяющего дробить без использования пламени и позволяет лаборатории C. elegans функционировать без переключения методов между стерилизацией различных объектов.

Как указано в таблице 1, микросинераторы обеспечивают повышенную безопасность, повышенную совместимость с ламинарными проточными вытяжками и повышенную портативность по сравнению с методами, основанными на пламени, но имеют ограничения. Они являются более дорогостоящими, чем другие методы, и требуют времени прогрева до достижения температуры стерилизации. В заключение, этот метод, который обычно используется во многих микробиологических лабораториях, может быть применим в некоторых исследовательских и учебных лабораториях C. elegans , стремящихся повысить лабораторную безопасность без ущерба для стерильности.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
90% platinum 10% iridium wire	Tritech	PT-9010	Other sources and wire compositions may be used.
Agarose	Sigma Aldrich	A6013	LB agar ingredient
Bunsen burner	Fisher Scientific	50-110-1225	Other Bunsen burners may be used
Ethanol Lamp	Carolina	706604	Included here as a reference to Table 1
Lighter	Carolina	706636	Included here as a reference to Table 1
Loop holder accessory	Fisher	22-630-002	Referred to in the manuscript as "guide"
Micro-incinerator	Thomas Scientific	1154J15	There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001),  Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702).
N2 worms	CGC	N2
NaCl	Sigma Aldrich	S5886	LB ingredient
OP50 E. coli	CGC	OP50
Petri dish	Fisher	08-772B
Pick handle	Tritech	TWPH1
Scalpel blade	Fisher	12-000-161
Scalpel handle	Fisher	12-000-164
Spatula	Fisher	14-374	Other spatulas will work
Sterile cell spreaders	VWR	76206-438	Other cell spreaders may be used as long as they are sterile
Tryptone	Sigma Aldrich	T7293	LB ingredient
Yeast Extract	Sigma Aldrich	Y1625	LB ingredient