JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает методологию генетической абляции пигментного эпителия сетчатки (RPE) с использованием трансгенной модели рыбок данио. Адаптация протокола для включения модуляции сигнального пути с использованием фармакологических соединений подробно описана. Была разработана и обсуждается платформа MATLAB для количественной оценки регенерации RPE на основе пигментации.

Аннотация

Пигментный эпителий сетчатки (RPE) находится в задней части глаза и выполняет функции, необходимые для поддержания здоровья и целостности соседних тканей сетчатки и сосудов. В настоящее время ограниченная репаративная способность RPE млекопитающих, которая ограничена небольшими травмами, препятствует прогрессу в понимании регенеративных процессов RPE in vivo . Здесь представлена подробная методология, облегчающая изучение восстановления RPE in vivo с использованием рыбки данио, модели позвоночных, способной к надежной регенерации тканей. Этот протокол описывает трансгенную нитроредуктазу/метронидазол (NTR/MTZ)-опосредованную парадигму повреждения (rpe65a:nfsB-eGFP), которая приводит к абляции центральных двух третей RPE после 24-часового лечения MTZ с последующим восстановлением тканей. Основное внимание уделяется абляции RPE у личинок рыбок данио, а также изложены методы тестирования влияния фармакологических соединений на регенерацию RPE. Также обсуждается генерация и валидация RpEGEN, скрипта MATLAB, созданного для автоматизации количественной оценки регенерации RPE на основе пигментации. Помимо активных механизмов восстановления RPE, этот протокол может быть расширен до исследований дегенерации RPE и реакций на травмы, а также влияния повреждения RPE на соседние ткани сетчатки и сосудов, среди других клеточных и молекулярных процессов. Эта система рыбок данио имеет значительные перспективы в выявлении генов, сетей и процессов, которые управляют регенерацией RPE и механизмами, связанными с болезнью RPE, с долгосрочной целью применения этих знаний к системам млекопитающих и, в конечном счете, к терапевтическому развитию.

Введение

Методология, описанная в настоящем описании, детализирует протокол генетической абляции пигментного эпителия сетчатки (RPE) с использованием личинок рыбок данио. RPE простирается над задней частью глаза и находится между стратифицированными слоями нервной сетчатки и слоем сосудистой системы, составляющим сосудистую оболочку. Трофическая поддержка, поглощение фототоксического света и поддержание белков зрительного цикла являются лишь некоторыми из критических функций, выполняемых RPE, которые необходимы для поддержания здоровья и целостности этих смежных тканей1. Повреждения РПЭ млекопитающих поддаются исправлению, когда поражения небольшие2; однако ущерб, нанесенный более крупными травмами или прогрессирующими дегенеративными заболеваниями, является необратимым. У людей дегенеративные заболевания RPE (например, возрастная макулярная дегенерация (ВМД) и болезнь Штаргардта) приводят к постоянной потере зрения и, при небольшом количестве доступных вариантов лечения, снижению качества жизни пациента. Ограниченная способность RPE млекопитающих к самовосстановлению создала пробел в знаниях в области регенеративных процессов RPE. Учитывая надежную регенеративную способность рыбок данио во многих различных типах тканей, этот протокол был разработан для создания системы позвоночных in vivo для облегчения исследований внутренне регенерирующего RPE и выявления механизмов, которые управляют этим ответом. Используя парадигму абляции, описанную здесь, канонический сигнальный путь Wnt3, путь mTOR4 и иммунные ответы5 были идентифицированы как критические медиаторы регенерации RPE, вероятно, с перекрывающимися функциями.

В этой парадигме генетической абляции Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 рыбки данио экспрессируют ген нитроредуктазы бактериального происхождения (NTR/nfsB)6, слитый с eGFP под контролем энхансерного элемента RPE, rpe65a7. Абляция достигается путем добавления пролекарства, метронидазола (MTZ), в систему воды, в которой содержатся рыбки данио. Внутриклеточная активация МТЗ нитроредуктазой приводит к сшиванию ДНК и апоптозу в NTR/nfsB-экспрессирующих клетках 8,9. Эта технология была широко использована у рыбок данио для удаления клеток сетчатки 10,11,12,13 и других тканей 8. Вместе эти элементы обеспечивают целенаправленную экспрессию (rpe65a) индуцируемой методологии абляции клеток (NTR/MTZ)8,9 и флуоресцентного маркера (eGFP) для визуализации.

Существуют и другие интересные модели in vivo, которые могут быть использованы для изучения регенеративного потенциала RPE14. Они являются широкими и включают трансдифференциацию RPE-to-retina после ретинэктомии у амфибий, при которой клетки RPE, потерянные при отрастании сетчатки, заменяются15,16; Восстановление РПЭ после травмы у «супер заживляющей» мыши MRL/MpJ17; и экзогенная стимуляция пролиферации RPE в крысиной модели спонтанной RPE и дегенерации сетчатки18, среди прочих. Также были разработаны модели in vitro, такие как взрослые стволовые клетки RPE человека (RPESCs)19. Все эти модели являются ценными инструментами, работающими над выявлением клеточных процессов, связанных с регенерацией RPE (например, пролиферация, дифференциация и т. Д.); тем не менее, рыбка данио уникальна своей способностью к внутреннему восстановлению RPE после абляции.

В то время как методология здесь написана, чтобы сосредоточиться на понимании механизмов, приводящих к регенерации RPE, линия Tg(rpe65a: nfsB-eGFP) и этот протокол генетической абляции могут быть использованы для изучения других клеточных процессов, таких как апоптоз RPE, дегенерация RPE и влияние повреждения RPE на соседние ткани сетчатки и сосудов. Протокол абляции также может быть модифицирован для включения фармакологических манипуляций, что является удобной предварительной стратегией для скрининга интересующих сигнальных путей. Например, было показано, что блокирование канонического пути Wnt с помощью ингибитора ответа Wnt-1 (IWR-1)20 ухудшает регенерацию RPE3. Это было повторено здесь, чтобы провести пользователей через фармакологический эксперимент манипуляции и служить доказательством концепции для проверки сценария MATLAB (RpEGEN), созданного для количественной оценки регенерации RPE на основе восстановления пигментации. Как и трансгенная линия и протокол абляции, скрипты RpEGEN адаптируются и могут быть использованы для количественной оценки других маркеров / клеточных процессов в RPE.

протокол

Все методологии, изложенные в настоящем документе, соответствуют требованиям Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Питтсбурга.

1. Подготовка перед сбором эмбрионов рыбок данио

  1. Установите инкубатор эмбрионов на 28,5°C.
  2. Готовят 25-кратный исходный раствор ингибитора меланогенеза N-фенилтиомочевины (ПТУ)21,22. Этот исходный раствор масштабируется по распространенной рецептуре22 и 1x равен 0,003% массы на объем (% мас./об.) (например, 0,003 г порошка ПТУ на 100 мл жидкого растворителя).
    1. Чтобы приготовить большой 25-кратный раствор PTU, добавьте 0,75 г порошка PTU в 1 л очищенной деионизированной воды (далее именуемой dH2O) и тщательно перемешайте при комнатной температуре (~25 °C), используя перемешивание и перемешиваемую пластину. Хранить при температуре 4°C до 3 месяцев под защитой от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трудно заставить ПТУ перейти в водный раствор, и может потребоваться длительное перемешивание в течение ночи.
      ВНИМАНИЕ: ПТУ опасен, и следует соблюдать осторожность, чтобы предотвратить проглатывание, вдыхание и / или контакт с кожей или глазами. Порошок PTU и все жидкие производные PTU, описанные в настоящем описании, возможно, потребуется утилизировать как химические отходы в зависимости от государственных и институциональных правил. Подтверждение надлежащих методов удаления отходов PTU, если таковые имеются, рекомендуется перед использованием.
    2. Чтобы сделать 1,5-кратный рабочий раствор PTU (далее именуемый 1,5x PTU), добавьте 60 мл 25x PTU-раствора к 940 мл воды для содержания рыбок данио (далее именуемой системной водой). Оптимальные параметры качества воды для рыбок данио были описаны23 , и водные объекты должны иметь стандартные процедуры мониторинга воды. Храните 1,5x PTU при температуре 28,5°C в течение 1-2 недель, защищенных от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол обычно выполняется с использованием концентраций PTU, растворителей и параметров хранения, описанных на этапе 1.2. В качестве меры предосторожности эмбрионы / личинки должны наблюдаться каждые 1-2 дня во время пребывания в ПТУ для подтверждения эффективности и подтверждения устойчивой депигментации. Условия растворения и/или хранения должны быть оптимизированы при подозрении на снижение растворимости/эффективности ПТУ.
  3. Приготовьте готовый раствор 0,05% мас./об.метиленового синего, ингибитора роста грибов, добавив 0,05 г порошка метиленового синего в 100 мл dH2O. Тщательно перемешайте, используя перемешивание и перемешиваемую пластину. Хранить при температуре 4°C.
  4. Подготовьте пипетки для манипуляций с эмбрионами /личинками (например, перемещение эмбрионов / личинок между чашками Петри, разделение личинок во время флуоресцентного скрининга, сбор усыпленных личинок в микроцентрифужные трубки для фиксации и т. Д.), Разрезая конический конец стеклянной пипетки Пастера с помощью ручки для записи алмазного наконечника. Вытравите по окружности пипетки алмазной ручкой и осторожно потяните или защелкните конец, чтобы сделать чистый разрыв.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рот пипетки должен быть гладким и достаточно широким, чтобы легко взять эмбрион внутри хориона без стрижки. Используйте в качестве альтернативы ленточную пипетку для рисования ламп. Подготовленные пипетки также могут быть использованы для удаления жидкости во время подмены воды (а не для разлива), чтобы свести к минимуму потерю эмбриона / личинки.
  5. Приготовьте 4% раствор параформальдегида (PFA) в 1x фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) (например, добавьте 10 мл 16% PFA к 4 мл 10x PBS и 26 мл dH2O). Хранить при температуре 4°C в течение 4 недель, защищенных от света.
    ВНИМАНИЕ: Параформальдегид является опасным химическим веществом и должен обрабатываться в химической вытяжке и утилизироваться должным образом. Следует соблюдать осторожность и носить средства индивидуальной защиты (СИЗ), чтобы предотвратить проглатывание, вдыхание и / или контакт с кожей или глазами.

2. Сбор и поддержание эмбрионов рыбок данио до генетической абляции (0-5 дней после оплодотворения)

  1. Содержать взрослых рыбок данио, как описано ранее 3,4,5. Во второй половине дня / вечером перед сбором эмбрионов отделите взрослых рыбок данио в резервуары для размножения для нереста.
  2. На следующее утро (через 0 дней после оплодотворения (dpf)) соберите эмбрионы в чашки Петри диаметром 10 см в системной воде и удалите все нежизнеспособные или неоплодотворенные яйцеклетки, которые будут казаться непрозрачными и / или показывать неправильную цитоплазму и неудачное расщепление24.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальное расщепление и события стадии развития будут проявляться у здоровых эмбрионов, как описано25. Чашки Петри должны быть заполнены на три четверти (~ 30 мл для чашки диаметром 10 см) на протяжении всего протокола.
    1. Добавьте две капли 0,05% мас./об.метиленового синего в каждую чашку Петри, аккуратно перемешайте и храните эмбрионы при температуре 28,5°C в течение оставшейся части протокола.
  3. Примерно через 6 ч после оплодотворения (hpf)4,5,26 замените системную воду в чашках эмбриона Петри 1,5x PTU (рабочий раствор, сделанный на этапе 1.2.2) и восполните метиленовый синий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PTU должен быть добавлен к эмбрионам до начала пигментации (т.е. до 24 hpf)25, так как уже пигментированные ткани не будут депигментироваться при добавлении PTU21. Следует, однако, отметить, что снижение размера глаз, глазного и черепно-лицевого дефицита и нарушение некоторых сигнальных путей (например, передачи сигналов щитовидной железы) были зарегистрированы у рыбок данио, обработанныхPTU 27,28,29. Токсичность PTU для развития, по-видимому, зависит от концентрации и сроков добавления PTU27,29. Как упоминалось выше для подтверждения эффективности ПТУ (этап 1.2), признаки токсичности ПТЕ также следует тщательно контролировать и, при подозрении, оптимизировать рабочую концентрацию и/или время добавления ПТУ.
  4. На 2-3 дпф дехорионат эмбрионов используют свежеприготовленный раствор проназы.
    1. Растворяют проназу в 1,5х ПТЕ в концентрации 2 мг/мл путем вихря.
      ВНИМАНИЕ: Проназа упакована в виде очень мелкого порошка и является раздражителем. Принимайте меры, чтобы избежать вдыхания и / или контакта с кожей, глазами и т. Д.
    2. Отделяйте вылупившиеся эмбрионы от невылупившихся эмбрионов и проназируйте только невылупившиеся эмбрионы.
    3. Замените 1,5x PTU раствором проназы 2 мг/мл, изготовленным на этапе 2.4.1, и оставьте на невылупившихся эмбрионах в течение 4-5 мин с мягким перемешиванием (например, на настольном ротаторе/шейкере или ручным закручиванием).
    4. Вылейте раствор проназы и немедленно промойте свежим 1,5x PTU. Аккуратно протритурируйте 1,5x PTU ополаскивайте эмбрионы с помощью переносной пипетки с колбой.
    5. Повторите второе промывание 1,5x PTU, чтобы выбросить весь мусор хориона, а затем пополните 1,5x PTU для обслуживания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы также могут быть дехорионированы вручную с помощью щипцов с мелким наконечником. В этом случае остатки хориона должны быть удалены и 1,5x PTU пополнены после ручной дехорионации.
  5. Следите за здоровьем эмбрионов / личинок и пополняйте 1,5x PTU каждые 1-2 дня. Эмбрионы/личинки содержатся в 1,5x PTU до абляции при 5 dpf.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важность шагов 2.3 и 2.4 более подробно рассматривается в разделе "Обсуждение".

3. Скрининг личинок рыбок данио на rpe65a:nfsB-eGFP и генетическая абляция пигментного эпителия сетчатки (5-6 дней после оплодотворения)

  1. Внесите свежий раствор метронидазола (МТЗ) 10 мМ на 5 dpf (день абляции). Этот процесс занимает 2 часа.
    1. Добавьте порошок МТЗ в системную воду без ПТУ и тщательно перемешайте путем энергичного встряхивания (например, 250 оборотов в минуту) в течение 1 ч при 37 °C.
    2. Охладите раствор МТЗ 10 мМт еще на 1 ч при комнатной температуре на настольном ротаторе/шейкере и обеспечьте полное растворение перед добавлением в чашки Петри личинок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный скрининг и разделение личинок eGFP+ (этап 3.2) могут быть выполнены во время инкубации при температуре 37 °C и комнатной температуре.
      ВНИМАНИЕ: MTZ опасен, и следует соблюдать осторожность, чтобы предотвратить проглатывание, вдыхание и / или контакт с кожей или глазами. Порошок МТЗ и все жидкие производные, описанные в настоящем описании, возможно, потребуется утилизировать как химические отходы в зависимости от государственных и институциональных правил. Подтверждение надлежащих методов удаления отходов МТЗ, если таковые имеются, рекомендуется перед использованием.
  2. Экран личинок рыбок данио для трансгена rpe65a:nfsB-eGFP.
    1. Обезболивание личинок 0,168 г/л трикаина (MS-222) и отдельных трансгенных (eGFP+) личинок (рисунок 1) от нетрансгенных (eGFP-) личинок с помощью флуоресцентного стереомикроскопа с лазером возбуждения/фильтром 488 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трикаин следует добавлять в 1,5-кратные растворы ПТУ и/или фармакологических соединений, поскольку личинки должны оставаться погруженными в обработку во время скрининга на eGFP. Инкубируйте личинок в трикане только на время скрининга (например, ≤10 мин для одной чашки Петри размером 10 см, содержащей 50 личинок).
    2. Немедленно отсеяли личинок, пипетировав их непосредственно в чашку Петри со свежим 1,5-кратным ПТУ без трикаина.
    3. По завершении скрининга дополнительно разделите личинок eGFP+ на две группы чашек Петри: одну группу для получения обработки MTZ (абляцию / MTZ +) и одну группу для неблаблированного (MTZ-) контроля.
  3. Абляция пигментного эпителия сетчатки.
    1. Удалите 1,5x PTU из неабляционной (MTZ-) контрольной посуды и добавьте пресную системную воду без PTU.
    2. Удалите 1,5x PTU из абляционной (MTZ+) посуды для обработки и добавьте свежеприготовленный раствор MTZ 10 мМ (шаг 3.1.).
    3. Удалите раствор МТЗ 10 мМ ровно через 24 ч (назначается через 1 день после травмы (dpi)) и добавьте пресную системную воду без ПТУ. Замените воду пресной системы без ПТУ на посуде (тарелках) МТЗ. Личинки не будут подвергаться воздействию PTU снова в течение оставшейся части протокола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть трудно пипетку или вылить все 1,5x PTU (шаги 3.3.1 и 3.3.2) или 10 мМ MTZ (шаг 3.3.3) между обменами раствора без потери личинок, поскольку животные активно плавают вокруг. В этом случае может быть добавлена промывка системной воды без ПТУ для обеспечения успешного обмена раствором.

4. Поддержание личинок постгенетической абляцией (6+ дней после оплодотворения)

  1. Проверяйте личинок и пополняйте систему воды без ПТУ ежедневно до эвтаназии (шаг 5.6) или возвращения в жилище для рыбок данио.
  2. Мониторинг успешности и степени абляции in vivo на 2 dpi (7 dpf) с помощью пропускаемой световой подсветки на стереомикроскопе (рисунок 2).

5. Включение фармакологического лечения в протокол абляции пигментного эпителия сетчатки рыбок данио

ПРИМЕЧАНИЕ: Как и ранее3, обработка 15 мкМ IWR-1 или соответствующим по объему диметилсульфоксидом (DMSO) управление транспортным средством, начиная с 4 dpf, описана здесь в качестве примера эксперимента по испытанию RpEGEN. Концентрации и сроки могут варьироваться в зависимости от различных фармакологических соединений, а рекомендации по валидации «доза-реакция», продолжительность лечения, скрининг и другие аспекты экспериментального дизайна для фармакологических исследований манипуляций рассматриваются в разделе «Обсуждение». Выполните шаги 6 и 7, если требуется анализ изображения.

  1. Собирайте и поддерживайте эмбрионы, как описано в шаге 2. Дехорионатные эмбрионы по 2 дпф.
  2. Экранирование личинок eGFP+ на 4 dpf, как описано в шаге 3.2. Вместо чашки Петри поместите личинки eGFP+ в 6-луночные пластины с плотностью n ≤ 10 личинок на 6 лунок для фармакологического лечения. Обозначьте отдельные 6-луночные пластины для личинок, которые будут неабляционными (MTZ-) и личинок, которые будут абляции (MTZ+).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал eGFP виден на 4 dpf, но выглядит тусклее, чем интенсивность сигнала на 5 dpf.
  3. Предварительно обработать 4 dpf eGFP+ личинок с 15 мкМ IWR-1 или согласованным по объему DMSO контролем транспортного средства в течение ровно 24 ч до генетической абляции раствором МТЗ 10 мМТЗ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Часто для фармакологических экспериментов по лечению требуется очень мало соединения. Чтобы избежать взвешивания небольших количеств порошка IWR-1, это фармакологическое соединение приобретается уже в растворе DMSO, в концентрации 25 мМ, и аликвотируется в меньшие объемы по прибытии, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания.
    1. Определите объем необходимых фармакологических и контрольных методов лечения и соответственно аликвотируйте 1,5x PTU в конические трубки. Рекомендуется объем 5 мл/лунка плиты из 6 скважин.
    2. Добавьте запас IWR-1 к 1,5x PTU для конечной концентрации 15 мкМ IWR-1 (например, 3 мкл 25 мМ IWR-1 на 5 мл 1,5x PTU). Добавьте соответствующий объем запаса DMSO к 1,5x PTU (например, 3 мкл ≥ 99,7% DMSO на 5 мл 1,5x PTU). Здесь это в конечном итоге приведет к конечной концентрации DMSO 0,06% объема / объема (% v / v). Хорошо перемешайте путем вихря и визуально подтвердите растворение соединений.
      ВНИМАНИЕ: DMSO, IWR-1 и другие фармакологические соединения и растворители, возможно, потребуется утилизировать как химические отходы в зависимости от государственных и институциональных правил. Подтверждение уровня опасности и надлежащих методов удаления отходов для этих соединений, если таковые имеются, рекомендуется перед использованием.
    3. Удалите 1,5x PTU из личинок eGFP+ в 6-луночных пластинах и добавьте 5 мл /лунку свежеприготовленного 0,06% v/v DMSO или 15 мкМ IWR-1 с этапа 5.3.2.
  4. На 5 dpf абляция RPE. В дополнение к 24-часовой предварительной обработке (стадия 5.3), личинки будут оставаться погруженными в фармакологическую и контрольную обработку транспортных средств в течение 24 ч генетической абляции с 10 мМТЗ и во время постабляционного восстановления, до фиксации (например, от 4-9 дПФ).
    1. Принимают раствор МТЗ 10 мМТЗ за 2 ч до выполнения генетической абляции (шаг 3.1).
    2. Определите объем фармакологических и контрольных обработок транспортных средств, необходимых как для неблатированных (MTZ-), так и для абляционных (MTZ+) 6-луночных пластин и аликвотных соответствующих объемов либо пресной системной воды без PTU (MTZ-), либо 10 мМ раствора MTZ (MTZ+) в конические трубки. Это даст четыре условия лечения: 1) 0,06% v/v DMSO, MTZ-; 2) 15 мкМ ИВР-1, МТЗ-; 3) 0,06% об/об ДМСО, МТЗ+; и 4) 15 мкМ IWR-1, MTZ+.
    3. Добавить растворы IWR-1 и DMSO в соответствующие конические трубы, как это выполнено на этапе 5.3.2. Хорошо перемешайте путем вихря и визуально подтвердите растворение соединений.
    4. Удалите 0,06% v/v DMSO и 15 мкМ IWR-1 в 1,5x PTU (этап 5.3.2) из назначенных неблэтированных (MTZ-) и абляционных (MTZ+) 6-луночных пластин и пополните их соответствующими обработками, выполненными на этапе 5.4.3.
    5. Удалите 0,06% v/v DMSO и 15 мкМ IWR-1 в 10 мМ растворе MTZ ровно через 24 ч и пополните обработкой в пресной системной воде без ПТУ. Восполняйте 0,06% v/v DMSO и 15 мкМ IWR-1 обработки в пресной системной воде без ПТУ на неабляционной (MTZ-) 6-луночной пластине (пластинах).
  5. Следуйте за поддержанием личинок после абляции, как описано в шаге 4, и ежедневно пополняйте 0,06% v/v DMSO или 15 мкМ IWR-1 в системной воде без PTU.
  6. Усыпляйте личинок на 9 dpf (4 dpi для братьев и сестер, обработанных MTZ в соответствии с возрастом), погружая животных в раствор трикаина 0,3 г / л (смертельная передозировка) в сочетании с быстрым охлаждением (например, поместите чашки Петри на лед) в течение не менее 20 мин30. Проверьте, чтобы убедиться, что личинки не реагируют на прикосновение, и зафиксируйте 4% PFA (шаг 1,5) в течение 3 ч при комнатной температуре или при 4 °C в течение ночи.
  7. Обработать постфиксационную личиночную ткань для получения изображения z-стека на конфокальном микроскопе, как описано ранее 5,31 и здесь, в разделе Репрезентативные результаты. Анализ на этапах 6 и 7 потребует, как минимум, получения ядерного маркера (например, DAPI) и изображений z-стека яркого поля.

6. Препроцессорная обработка изображений z-стека конфокальным микроскопом в FIJI (ImageJ)

  1. Импорт и форматирование изображений z-стека конфокального микроскопа с помощью FIJI32.
    1. Открывайте изображения микроскопа с помощью параметров импорта биоформатов , для которых установлено значение Просмотр стека с помощью: Гиперстек и Цветовой режим: Оттенки серого.
    2. Создайте проекцию максимальной интенсивности импортированного изображения микроскопа, выбрав Image | Стеки | Проект Z. В окне ZProjection задайте для параметров Начальный фрагмент и Стоп-фрагмент , чтобы включить все фрагменты для этого изображения. Например, задайте начальный фрагмент: 1 и стоп-фрагмент: 18 для z-стека, содержащего в общей сложности 18 фрагментов. Выберите Тип проекции: Максимальная интенсивность и нажмите OK.
    3. Преобразуйте файл проекции максимальной интенсивности в 8-битное изображение (если еще нет), выбрав Image | Тип | 8-бит.
    4. Переориентируйте изображение так, чтобы спинная сторона была вверху, а дистальная (т. е. объектив) оставалась, выбрав «Изображение | Трансформация | Отразить по горизонтали (для последней команды выберите параметр, который наилучшим образом соответствует направленности, необходимой для этого изображения). Чтобы получить многоканальное изображение, нажмите кнопку Да в стеке процессов? для переориентации всех каналов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является критическим, но не нужен, если изображение уже находится в дорсальной, дистальной левой ориентации. См. рисунки 3A-D и 4 для изображений с глазами в правильном направлении для обработки.
    5. Сохраните 8-битную проекцию максимальной интенсивности в виде TIF-файла с тегами, выбрав Файл | Сохранить как | Тифф....
  2. Создайте интересующую область RPE (ROI) с помощью FIJI.
    1. Откройте 8-разрядный TIF-образ, созданный, как описано в шаге 6.1. Запустите менеджер окупаемости инвестиций, выбрав Анализ | Инструменты | Менеджер по окупаемости инвестиций.
    2. Использование | изображений Масштабирование и переключение между каналами DAPI и Brightfield для определения точки (точек), в которой апикальная сторона RPE примыкает к кончику внешней ограничивающей мембраны (OLM) (рисунок 3B', B", D', D"; синие наконечники стрелок). Используйте этот анатомический ориентир в качестве отправной точки ROI.
    3. Создайте рентабельность инвестиций в RPE с помощью инструмента «Выделение полигонов» (на панели инструментов FIJI), используя каналы изображения DAPI и brightfield, а также функцию масштабирования (Image | Zoom) для определения апикальных и базальных границ RPE. Дорсальный и вентральный концы ROI (т. е. там, где ROI переходит с апикальной на базальную сторону RPE) в острую точку, а не притупление или округление (рисунок 3B', B", D', D"; пурпурные линии).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Создание заостренного конца окупаемости инвестиций является критическим шагом для оптимизации обнаружения конечных точек с помощью RpEGEN и рассматривается в разделе Обсуждение.
    4. Добавьте рентабельность инвестиций, нажав кнопку Добавить в менеджере ROI. Отрегулируйте рентабельность инвестиций по мере необходимости и нажмите «Обновить » в менеджере ROI.
    5. Сохраните файл окупаемости инвестиций, выбрав Дополнительно>> | Спасать... в рамках менеджера ROI. Используйте одинаковые имена для совпадающих файлов изображений ROI и TIF (например, [имя файла].tif и [имя файла].roi).
  3. Объедините 8-разрядные файлы TIF и ROI для каждого условия в одну папку. Например, папка DMSO_9dpf будет содержать все соответствующие файлы TIF и ROI для 9 dpf unablated (MTZ-) 0,06% v/v DMSO-обработанной личиночной группы.

7. Количественная оценка и визуализация регенерации RPE с помощью скриптов RpEGEN

  1. Установите и подготовьте скрипты RpEGEN.
    1. Загрузите последние скрипты RpEGEN из репозитория GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN), щелкнув Code | Скачать ZIP.
    2. Распакуйте папку и поместите ее в нужное место рабочей области (например, рабочий стол).
    3. Откройте MATLAB.
    4. Перейдите в папку RpEGEN на панели «Текущая папка » (обычно слева).
    5. Щелкните правой кнопкой мыши папку RpEGEN и выберите Добавить в путь | Выбранные папки и вложенные папки. Это добавит папку в путь MATLAB, чтобы она могла автоматически находить и запускать любые сценарии в папке.
    6. Дважды щелкните папку RpEGEN на панели «Текущая папка», чтобы отобразить все вложенные папки и M-файлы.
    7. Дважды щелкните файл RpEGEN.m , чтобы открыть его в области редактора .
    8. В разделе USER-DEFINED VARIABLES файла RpEGEN.m введите расположение каталогов для папок, содержащих файлы ROI (.roi), файлы изображений (.tif) и места, где должны быть сохранены выходные файлы. Введите имя группы для экспортируемого файла .mat (например, DMSO_9dpf, DMSO_4dpi и т. д.) и расположение канала brightfield в стеке изображений TIF (например, 3, если brightfield является третьим каналом в стеке изображений). Если файл изображения содержит только изображение яркого поля, то это должно быть равно 1.
  2. Запустите скрипт RpEGEN.m и проверьте результаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: RpEGEN требует, чтобы инструментарий обработки изображений, инструментарий Curve Fitting Toolbox и инструментарий статистики и машинного обучения были активированы на пользовательской лицензии MATLAB для запуска. Кроме того, для импорта FIJI ROI в MATLAB требуется свободно доступный набор инструментов ReadImageJROI33 ; однако он предоставляется в папке RpEGEN вместе с другими файлами функции M, которые не требуют какой-либо активации.
    1. Запустите сценарий, нажав кнопку Выполнить в меню Редактор в верхней части MATLAB.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После запуска командное окно предоставит подробные выходные данные, указывающие на прогрессию скрипта. После сохранения файла MAT, содержащего извлеченные данные, появится трехпанельная фигура, которая будет сохранена в виде PDF в выходном каталоге для каждого запуска изображения. Это показатели контроля качества (QC), чтобы убедиться, что все работает правильно и включает: 1) изображение яркого поля, наложенное ROI (рисунок 4A); 2) ROI с осевой линией и связанным с ней угловым расстоянием (градусами) (рисунок 4G); и 3) ROI со средними значениями интенсивности осевой линии (0-255, 8-битная цветовая шкала) (рисунок 4H). Подождите, пока PDF-файлы QC не будут сохранены в выходной папке и последний рисунок исчезнет, прежде чем переходить к следующему шагу.
    2. Откройте отдельные PDF-файлы, экспортированные в выходную папку в любом средстве просмотра PDF, и убедитесь, что все ROI соответствуют ярким изображениям, что значения осевой линии являются разумными приближениями к центру ROI и что значения медианной интенсивности соответствующим образом заполнены данными (т. Е. Не все одинаковые значения по всей осевой линии).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание и структуру каждой переменной, сохраненной в файле MAT компанией RpEGEN.m, можно найти в таблице 1.
  3. Запустите сценарий RpEGEN_PermPlot.m.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипт RpEGEN_PermPlot.m использует выходные данные RpEGEN.m для выполнения статистических сравнений с использованием перестановочного моделирования медиан двух групп, а также предоставляет код для воспроизведения графиков в этой статье с использованием свободно доступного набора инструментов GRAMM34, который также был включен в папку RpEGEN.
    1. Дважды щелкните файл RpEGEN_PermPlot.m , чтобы открыть его в новой вкладке редактора .
    2. В разделе РАЗДЕЛ 1 - ОПРЕДЕЛЯЕМЫЕ ПОЛЬЗОВАТЕЛЕМ ПЕРЕМЕННЫЕ в файле RpEGEN_PermPlot.m введите расположение каталога выходной папки, содержащей файлы MAT из запущенного RpEGEN.m, и введите имя каждого загружаемого файла MAT (например, DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. Запустите этот раздел скрипта, нажав на кнопку Выполнить раздел в меню Редактор в верхней части MATLAB.
    4. В разделе 2 введите названия двух групп для статистического сравнения в data_A и data_B переменных (это группы, из которых будут выведены медианы с помощью моделирования перестановок). В переменной bin_sz введите количество градусов, по которым необходимо интегрировать медианные значения интенсивности для наборов данных (по умолчанию — 1 градусные корзины).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переменная reps указывает количество перестановок, используемых для построения распределения вероятностей, и может быть установлена на любое число (значение по умолчанию 20 000). В целом, большее количество повторений будет более статистически устойчивым, но увеличит время обработки.
    5. Запустите этот раздел скрипта, нажав на кнопку Выполнить раздел в меню Редактор в верхней части MATLAB. Выполнение этого раздела может занять некоторое время в зависимости от указанного количества повторений, но обеспечивает непрерывное обновление состояния в командном окне.
    6. Запустите разделы HEATMAP FIGURE и GROUP RESULTS И P-VALUES независимо друг от друга с помощью кнопки Run Section . Редактируйте переменные данных в любых разделах, закомментированных с помощью "ENTER DATA HERE". PDF-файлы этих рисунков автоматически сохраняются для каждого и могут быть легко изменены в любом векторном программном постобработке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Графики, сгенерированные в файле RpEGEN_PermPlot.m , являются специальными и, вероятно, потребуют модификации на основе конкретных данных и потребностей каждого пользователя в визуализации. Тем не менее, цифры обеспечивают прочную основу, которую можно легко индивидуализировать с помощью веб-сайтов MATLAB и GRAMM.

Результаты

Известно, что ингибирование канонического сигнального пути Wnt значительно ухудшает регенерацию RPE рыбок данио с использованием парадигмы генетической абляции (rpe65a: nfsB-eGFP) и методологии фармакологических манипуляций (IWR-1), описанной в протоколе3. Этот эксперимент был п?...

Обсуждение

Этот протокол описывает методологию генетической абляции RPE и изучает механизмы дегенерации и регенерации у личиночных рыбок данио. Этот протокол также был успешно выполнен у взрослых рыбок данио3, но с менее обширной характеристикой, поэтому личинки находятся в центре вн...

Раскрытие информации

L.L.L. является соавтором патента США No 9,458,428, который описывает ускоренный метод получения пигментного эпителия сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека; это не связано с содержанием настоящего документа. J.M.G. и G.B.F. нечего раскрывать.

Благодарности

Работа, описанная здесь, была поддержана Национальными институтами здравоохранения (RO1-EY29410 для J.M.G и грант NIH CORE P30-EY08098 для департамента офтальмологии); Центр иммунной трансплантации и терапии UPMC (для L.L.L. и J.M.G.); и кафедра офтальмологических исследований Э. Рональда Сальвитти (дж.м.г.). Дополнительная поддержка была получена от стипендии Виганда в области офтальмологии (L.L.L.), Фонда глаз и ушей Питтсбурга и неограниченного гранта от Research to Prevent Blindness, New York, NY. Авторы также хотели бы поблагодарить Аманду Платт за техническую помощь и доктора Хью Хаммера и персонал водных видов спорта за отличную поддержку по уходу за животными.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)Millipore SigmaD9542
6-well platesFisher Scientific07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific05-539-13Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing penFisher Scientific50-254-51Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 %Fisher ScientificBP231Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large)Fisher Scientific3720A
Embryo incubator (mini/tabletop)LabnetI5110A
Fluorescence stereo microscopeZeissAxio Zoom.V16Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipetteFisher Scientific13-678-4Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endoMillipore Sigma5.04462Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder)Fisher ScientificBP117-100Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ)Millipore SigmaM3761Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU)Millipore SigmaP7629Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol freeFisher ScientificAA433689MChemical waste, proper disposal required
Petri dishesFisher ScientificFB087571210 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets)Millipore SigmaP3813Used to make 10 X PBS stock
PronaseMillipore SigmaPRON-RO
Shaking incubatorBenchmarkH2010Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscopeLeicaS9iOr similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forcepsFine Science Tools91150-20Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shakerScilogexSK-D1807-E
Transfer pipetteMillipore SigmaZ1350033.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222)PentairTRS1, TRS2, TRS5Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ)FIJI (Fiji is Just ImageJ)https://imagej.net/software/fiji/Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tosMathWorkshttps://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/get-matlab.htmlToolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB supportMathWorkshttps://www.mathworks.com/support.html

Ссылки

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. . Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  23. Hammer, H. S. . Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. . Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. . GitHub - ReadImageJROI Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021)
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

181RpEGEN

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены