Генерация мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека и их дифференцировка в линию скелетных мышц

Резюме

Описан протокол выделения мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека и их дифференцировки в линию скелетных мышц.

Аннотация

Изучение терапевтического потенциала мезенхимальных стволовых клеток зависит от легкости изоляции, способности к дифференцировке, а также надежности и надежности источника. Мы описываем здесь поэтапный протокол выделения мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека (uMSCs), их иммунофенотипирования и распространения таких культур в течение нескольких проходов. В этой процедуре жизнеспособность uMSC высока, потому что нет ферментативного пищеварения. Далее удаление кровеносных сосудов, включая пуповинные артерии и вену, обеспечивает отсутствие загрязнения клеток эндотелиального происхождения. Используя проточную цитометрию, uMSC при выделении получают CD45⁻CD34⁻, что указывает на отсутствие клеток в кроветворной линии. Важно отметить, что они выражают ключевые маркеры поверхности, CD105, CD90 и CD73. После создания культур в данной работе описывается эффективный метод индуцирования дифференцировки в этих умСК в линию скелетных мышц. Детальный анализ миогенной прогрессии в дифференцированных умСК показывает, что умСК экспрессируют Pax7, маркер миогенных предшественников на начальных стадиях дифференцировки, за которым следует экспрессия MyoD и Myf5, и, наконец, терминальный маркер дифференцировки, тяжелая миозиновая цепь (MyHC).

Введение

Считается, что пуповина человека обладает надежным резервуаром мезенхимальных стволовых клеток, которые в настоящее время исследуются для регенеративной терапии из-за их надежной скорости пролиферации и дифференцировки, иммуномодулирующих свойств и способности генерировать клетки из всех трех зародышевых слоев¹. Пуповинная ткань состоит из нескольких компартментов, таких как пуповинная кровь, субэндотелий пуповинной вены и желе Уортона (WJ), которое само по себе охватывает три нечеткие области - периваскулярную зону, межсосудистую зону и субамнион или подкладку пуповины (CL)². Хотя uMSC могут быть изолированы от всех этих различных регионов и широко выражать ключевые маркеры MSC, нет ясности в отношении того, содержат ли эти отсеки одну и ту же популяцию uMSC или демонстрируют различия в их дифференциационных потенциалах³. Следовательно, протоколы изоляции умСК требуют большей точности в их режиме и области изоляции, надежной характеристики потенциалов дифференциации и, наконец, сравнительного анализа из разных отсеков шнура.

В этом контексте немногие исследования продемонстрировали различия в пролиферативных и дифференцирующих потенциалах uMSC между различными частями пуповины. Из них сравнительный анализ между uMSCs, выделенными из областей CL и WJ, выявил больший пролиферативный потенциал в uMSCs, полученных из CL ^3,4. В отдельном исследовании uMSC, полученные из WJ, показали лучшие результаты в анализах пролиферации по сравнению с периваскулярными клетками (HUCPV)⁵. При изучении различий между uMSC, полученными из пуповинной крови, и uMSC, полученными из пуповинной ткани, лишенными сосудистого загрязнения, сообщалось о дифференциальной экспрессии ключевых маркеров MSC между двумя компартментами, а также об увеличении скорости пролиферации в uMSCs⁶, полученных из пуповинной ткани.

Из нескольких исследований, изучающих потенциалы дифференциации uMSCs в основном в тканях линии мезодермы, таких как остеогенные, адипогенные и хондрогенные линии, очень немногие предоставили подробные протоколы для миогенной дифференциации и последующей характеристики, а также сравнительный анализ между различными отсеками пуповины. В этом контексте мы разработали надежный протокол дифференцировки мышц и отметили, что uMSCs, полученные из пуповинной ткани, демонстрируют превосходные возможности миогенной дифференцировки по сравнению с пуповинной кровью⁶. Здесь подробно описан поэтапный протокол для выделения uMSC из всей ткани пуповины, лишенной клеток, связанных с сосудистой системой, их характеристики и их дифференцировки в миогенную линию.

протокол

Использование ткани пуповины в этом исследовании было одобрено Институциональным комитетом по исследованию стволовых клеток (IC-SCR), Комитетом по институциональной этике, Институтом науки и технологии трансляционного здравоохранения (IEC-THSTI), Комитетом по институциональной этике гражданской больницы, Гуруграм, Харьяна, и Институциональным комитетом по биобезопасности, THSTI. Образцы пуповинной ткани человека были собраны из доношенных родов во время родов. Информированное письменное согласие было получено от субъектов. Все методы проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами.

1. Выделение МСК из ткани пуповины

1. Во время родов отрезают по меньшей мере 5 см пуповины, предпочтительно ближе к плаценте, и стерилизуют пуповину, смазывая внешнюю поверхность 70% этанолом. Перенесите кусок ткани пуповины последовательно из одной 50 мл коллекторной трубки, содержащей фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), в другую, содержащую то же самое. Транспортируйте на льду сборную трубку с именем субъекта в лабораторию в течение 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для более крупного исследования может быть полезно штрих-кодировать образцы, чтобы их можно было отслеживать на протяжении всего исследования. Важно отметить, что всему персоналу, работающему с тканями человека, должен быть предложен полный режим вакцинации против гепатита В.
2. В лаборатории включите ультрафиолетовое излучение в течение 25 минут в капоте BSL-2, чтобы стерилизовать автоклавные инструменты и пипетки перед использованием.
3. Перенесите кусок пуповинной ткани из коллекционной трубки в чашку размером 10^см2 , обработанную культурой ткани, содержащую PBS, обогащенную 5 г / л глюкозы, 50 мкг / мл гентамицина, 2,5 мкг / мл амфотерицина B, 100 ЕД / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (схема на рисунке 1).
4. Используя скальпель, нарежьте ткань пуповины вертикально вдоль ее продольной оси, чтобы получить два полуцилиндрических куска. Из-за перекрута пуповины и слизистой поверхности зафиксируйте ткань парой щипцов, удерживаемых в другой руке.
5. В этот момент наблюдайте за пупочными артериями и венами и удаляйте кровеносные сосуды с помощью скальпеля, чтобы соскоблить их в одном направлении с поверхности. Промыть ткань пуповины еще раз в PBS, чтобы удалить всю остаточную кровь, связанную с тканью. Убедитесь, что соскоб мягкий, чтобы сохранить целостность клеток в WJ, окружающих сосуды.
6. Измельчите каждую половину ткани пуповины на фрагменты размером 0,5^см3 и поместите осколки просветной поверхностью вниз на блюдо. Инкубировать блюдо кратковременно в течение 10 мин в увлажненной камере с температурой 37 °C, содержащей 5% CO₂.
7. После инкубации залить блюдо, содержащее кусочки ткани пуповины, 20 мл среды, содержащей MEM Alpha Modification без L-глутамина, рибо- и дезоксирибонуклеозидов, 15% фетальной бычьей сыворотки (не инактивированной теплом) и 50 мкг/мл гентамицина. Осторожно добавьте питательную среду по бокам, чтобы предотвратить смещение тканевых эксплантов от их ориентации. Добавьте избыточную среду, чтобы учесть фракцию, которая будет впитываться тканевыми эксплантами во время инкубации.
8. После 3 дней инкубации добавить в культуры свежую среду. Убедитесь, что культуры защищены от ударов и движения эксплантов во время работы с посудой.
9. Через 1 неделю удаляют фрагменты тканей по отдельности с помощью стерильных щипцов и выбрасывают, используя соответствующие пакеты биологической опасности для утилизации. Сохраните существующую среду и добавьте 10 мл свежей питательной среды. Заменяйте питательную среду каждые 4 дня, пока отдельные колонии не достигнут слияния 70%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вполне вероятно, что клетки не будут равномерно распределены по всему блюду, так как будут отдельные пролиферативные колонии, которые необходимо контролировать для слияния со временем. Как правило, в течение месяца блюдо размером 10^см2 генерирует достаточно клеток, чтобы быть разделенным на отдельное блюдо.
10. Соберите адгезивные клетки, используя раствор трипсина/ЭДТА (1x 0,25% трипсина и 0,02% ЭДТА в растворе сбалансированной соли Хэнкса [HBSS]). Центрифугируют клеточную суспензию при 470 × г в течение 5 мин при 25 °С и повторно суспендируют клеточную гранулу в питательной среде.

2. Иммунофенотипирование и распространение uMSCS

1. Приступают к иммунофенотипированию, как только адгезивные клетки достигнут 50-60% слияния и хорошо распространятся. Не выполняйте анализ маркеров MSC на полностью сливающихся культурах, так как это имеет тенденцию вызывать понижение регуляции ключевых маркеров MSC.
2. После трипсинизации распределяют клеточную суспензию 1 × 10⁶ клеток/мл в пробирках FACS (1 × 10⁵ клеток/трубку) и окрашивают соответствующими флуорофор-связанными антителами (все разведение 1:50) в комбинации: неокрашенные; CD105 + CD90; CD105 + CD73; СД105; CD90; СД73; CD34 + CD45 (общий флуорофор); контроль изотипа для каждого флуорофора. Запишите общее количество событий не менее 10 000 на проточном цитометре для дальнейшего анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку клетки анализируются для каждого маркера поверхности отдельно, наложение на подмножества ячеек не требуется.
3. В дополнение к вышеуказанным маркерам, подтверждают наличие положительных и отрицательных поверхностных маркеров в линиях uMSC, созданных из отдельных образцов ткани пуповины (таблица 1).
4. Анализ меченых клеток методом проточной цитометрии и определение процента клеток CD105⁺CD90⁺ и CD105⁺CD73⁺ . Анализ клеток CD105⁺ и CD34⁻CD45⁻ по отдельности.

3. Дифференциация умСК в скелетные мышцы

1. Покрывайте пластины культуры тканей 0,01% коллагеном и 20 мкг/мл ламинина в PBS. Покрывайте эти пластины минимум 4 ч при комнатной температуре.
2. Пластинчатые умСК при плотности 10 000 клеток/^см2 в питательной среде.
3. Когда клетки на 70% сливаются, аспирируйте питательную среду и промывайте культуры в 2 раза PBS. Добавьте к uMSCs миогенную дифференцировочную среду (M1), состоящую из DMEM + 5% конской сыворотки + 0,1 мкМ дексаметазона + 50 мкМ гидрокортизона. Для определения кинетики миогенного прогрессирования добавляйте в культуры среду М1 через день.
4. Для определения кинетики миогенного прогрессирования анализируют uMSCs на экспрессию Pax7, MyoD, миогенина и MyHC через 2 дня, 4-5 дней, 6-7 дней и 10-14 дней соответственно.

Результаты

Успех выделения умСК из пуповинной ткани составляет >95%, в отличие от плохих показателей успеха из цельноповинной крови. После успешной изоляции uMSC анализ FACS показывает, что все клетки являются CD34⁻CD45⁻CD105⁺CD90⁺. Однако в сравнительном анализе uMSCs, выделенные из пупо?...

Обсуждение

Критические шаги
Критическим этапом в этом протоколе является сбор ткани в асептических условиях, от момента доставки до поддержания стерильных культур, в течение всего периода размножения. Во время сбора пуповины важно, чтобы шнур не касался какой-либо нестерилизованной п?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline)	HiMedia	A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody	Sigma Aldrich	G8795
Anti-MyHC antibody (My32)	Novus Biologicals	NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A)	Novus Biologicals	NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D)	Novus Biologicals	NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody	DSHB	DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	559869
Collagen Type 1	Merck	C8919
D (+) Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Dexamethasone	SIGMA	D4902
FACSCanto II or FACSAria III	BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil	GIBCO	10270106	not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9	BD Biosciences	551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2	BD Biosciences	557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59	BD Biosciences	557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581	BD Biosciences	555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30	BD Biosciences	555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10	BD Biosciences	560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6	BD Biosciences	557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555786
FlowJo software	BD Biosciences
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1264
Horse serum	HiMedia	RM1239
Hydrocortisone	Merck	H4001
Laminin	Merck	L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides	Hyclone	SH30568.FS	Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266	BD Biosciences	560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515	BD Biosciences	550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1	BD Biosciences	555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2	BD Biosciences	561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4	HiMedia	M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	HiMedia	TCL049-100mL