Количественная 3D-визуализация клеток, инфицированных Trypanosoma cruzi, спящих амастиготов и Т-клеток в интактных осветленных органах

Резюме

Настоящий протокол описывает флуоресцентную микроскопию и автоматизированные программные методы визуализации и точной количественной оценки размножающихся и спящих паразитов Trypanosoma cruzi и Т-клеток в неповрежденных, очищенных органах и тканях. Эти методы обеспечивают надежный способ оценки результатов лечения и предлагают новое понимание взаимодействия паразита и хозяина.

Аннотация

Болезнь Шагаса является забытой патологией, которая поражает миллионы людей во всем мире, в основном в Латинской Америке. Возбудитель болезни Шагаса, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), является облигатным внутриклеточным паразитом с разнообразной биологией, который заражает несколько видов млекопитающих, включая человека, вызывая сердечные и пищеварительные патологии. Надежное выявление инфекций T. cruzi in vivo уже давно необходимо для понимания сложной биологии болезни Шагаса и точной оценки результатов схем лечения. Текущий протокол демонстрирует интегрированный конвейер для автоматизированной количественной оценки клеток, инфицированных T. cruzi, в 3D-реконструированных, очищенных органах. Флуоресцентная микроскопия позволяет точно визуализировать и количественно оценивать активно размножающихся и спящих паразитов T. cruzi и иммунных эффекторных клеток в целых органах или тканях. Также был успешно принят конвейер CUBIC-HistoVision для получения равномерной маркировки очищенных органов антителами и ядерными пятнами. Очистка тканей в сочетании с 3D-иммуноокрашиванием обеспечивает непредвзятый подход к всесторонней оценке протоколов лечения лекарственными препаратами, улучшает понимание клеточной организации тканей, инфицированных T. cruzi, и, как ожидается, будет способствовать открытиям, связанным с иммунными реакциями против T. cruzi , повреждением тканей и восстановлением при болезни Шагаса.

Введение

Болезнь Шагаса, вызванная простейшим паразитом T. cruzi, является одной из самых забытых тропических болезней в мире, вызывая около 13 000 ежегодных смертей. Инфекция часто прогрессирует от острой к хронической стадии, вызывая сердечную патологию у 30% пациентов, включая аритмии, сердечную недостаточность и внезапную смерть ^1,2. Несмотря на сильный иммунный ответ хозяина, вызванный против паразита во время острой фазы, низкое количество паразитов хронически сохраняется на протяжении всей жизни хозяина в тканях, таких как сердце и скелетные мышцы. Несколько факторов, включая отсроченное начало адаптивн....

протокол

Это исследование было проведено в строгом соответствии с Политикой Службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных животных и Руководством Ассоциации по оценке и аккредитации аккредитации по уходу за лабораторными животными. Протокол использования животных (контроль инфекции T. cruzi у мышей-A2021 04-011-Y1-A0) был одобрен Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Джорджии. В6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J и C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J мыши (самки, 1-2 месяца) использовались для настоящего исследования. М....

Результаты

Фиксированные ткани CUBIC промывали PBS для удаления фиксаторов, а затем инкубировали с коктейлями CUBIC-L, основным буферным раствором аминоспиртов, которые извлекают пигменты и липиды из ткани, что приводит к обесцвечиванию ткани при сохранении тканевой архитектуры. Линии сетки на бумаге м.......

Обсуждение

Отсутствие обширной визуализации целых органов паразитов и иммунного ответа ограничивает понимание сложности взаимодействий хозяина и паразита и затрудняет оценку методов лечения болезни Шагаса. В настоящем исследовании был принят конвейер CUBIC для осветления и окрашивания неповреж.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-methylimidazole	Millipore Sigma	616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine	TCI	D1876
6-wells cell culture plates	ThermoFisher Scientific	140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment	Jackson Immuno Research Laboratories	315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment	Jackson Immuno Research Laboratories	111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647	Chromotek	gb2AF647-50
anti-RFP	Rockland	600-401-379
anti-α-SMA	Sigma	A5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse	The Jackson Laboratory	Strain #007914	Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse	The Jackson Laboratory	Strain #007914	Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 Iodide	ThermoFisher Scientific	B3582
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	#A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse	The Jackson Laboratory	Strain #032080	Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSO	Sigma	#C2278
Cleaning wipes Kimwipes	Kimberly-Clark	T8788
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit	TCI	C3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit	TCI	C3698
CUBIC-L	TCI	T3740
CUBIC-P	TCI	T3782
CUBIC-R+	TCI	T3741
Cyanoacrylate-based gel superglue	Scotch	571605
DiR (DiIC18(7); 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium	Biotium	#60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mL	Corning	CLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mL	Corning	CLS430290
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128
Heparin	ThermoFisher Scientific	J16920.BBR
Hyaluronidase	Sigma	#H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64	BitPlane	v9.2.0
Imaris software	BitPlane	v9.3
ImSpector software	LaVision BioTec, Miltenyi Biotec	v6.7
Intravenous injection needle 23-G	Sartori, Minisart Syringe filter	16534
Kimwipes			lint free wipes
Light-sheet fluorescent microscope	Miltenyi Biotec	ULtramicroscope II imaging system
Methanol	ThermoFisher Scientific	041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL	Axygen	T-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenser	Fisher Scientific, Fisherbrand	03-692-172
Mounting Solution	TCI	M3294
N-butyldiethanolamine	TCI	B0725
Nicotinamide	TCI	N0078
N-Methylnicotinamide	TCI	M0374
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain	Biotium	#40061
Sacrifice Perfusion System	Leica	10030-380
Scissors	Fine Science Tools	91460-11
Serological pipettes	Costar Sterile	4488
Shaking incubator	TAITEC	BR-43FM MR
Sodium azide (NaN3)	ThermoFisher Scientific	447815000
Sodium carbonate (Na2CO3)	ThermoFisher Scientific	L13098.36
Sodium Chloride (NaCl)	ThermoFisher Scientific	447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	ThermoFisher Scientific	014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7020
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787