Измерение роста скелетных мышц в реальном времени у отдельных живых рыбок данио, подвергшихся измененной электрической активности

Резюме

Оптическая прозрачность является основным преимуществом для биологической и физиологической работы клеток у рыбок данио. Описаны надежные методы измерения роста клеток у отдельных животных, которые позволяют по-новому взглянуть на то, как рост скелетных мышц и соседних тканей интегрирован с ростом всего тела.

Аннотация

Ряд методов может быть использован для визуализации отдельных клеток по всему телу живых эмбриональных, личиночных или молодых рыбок данио. Показано, что живые рыбы с флуоресцентно-маркированными плазматическими мембранами могут быть отсканированы в конфокальном лазерном сканирующем микроскопе с целью определения объема мышечной ткани и количества присутствующих мышечных волокон. Эффективные подходы к измерению количества и размера клеток у живых животных с течением времени описываются и проверяются с помощью более сложных методов сегментации. Описаны методы, позволяющие контролировать электрическую и, следовательно, сократительную активность мышц. Потеря сократительной активности скелетных мышц значительно снижает рост мышц. У личинок описан протокол, позволяющий повторно вводить узорчатую электрическую сократительную активность. Описанные методы минимизируют влияние межиндивидуальной изменчивости и позволят проанализировать влияние электрических, генетических, лекарственных или экологических стимулов на различные клеточные и физиологические параметры роста в контексте живого организма. Впоследствии может быть выполнено долгосрочное наблюдение за измеренными эффектами определенного вмешательства в раннем возрасте на людей.

Введение

Регулируемый рост тканей, включающий увеличение количества клеток (гиперплазия) и / или размера клеток (гипертрофия), является решающим фактором развития, регенерации и экологической и эволюционной адаптации. Несмотря на огромные успехи в молекулярно-генетическом понимании как клеточной биологии, так и биологии развития за последние десятилетия, механистическое понимание регуляции размера тканей и органов все еще находится в зачаточном состоянии. Одной из причин этого пробела в знаниях является сложность количественной оценки роста тканей в живых организмах с необходимой пространственной и временной точностью.

Различные аспекты роста целых ....

протокол

Все описанные исследования проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами и под соответствующими лицензиями Министерства внутренних дел Великобритании в соответствии с Законом о животных (научные процедуры) 1986 года и последующими изменениями. Эмбрионы/личинки следует выращивать при 28,5 °C до завершения гаструляции, но затем их можно держать при 22-31 °C для контроля скорости развития. Рыбу можно сканировать или стимулировать при комнатной температуре.

1. Обезболивание личинок рыбок данио

1. Скрещивайте подходящих флуоресцентных репортерных взрослых рыб, таких как Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-E....

Результаты

Быстрое и точное измерение объема сомита
Описан метод пробоподготовки, сбора данных и объемного анализа, позволяющий быстро измерить рост мышц у личинок рыбок данио. Размер мышц может быть измерен у живых животных с использованием рыбы, меченной на их плазматических мембран.......

Обсуждение

Здесь мы сообщаем о методе точной и эффективной оценки мышечного объема живых личинок рыбок данио на стадиях или в генетических вариантах, в которых пигментация не является большим препятствием для визуализации и когда транзиторная анестезия и / или иммобилизация хорошо переносятся. ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive, Blu Tack	Bostik	-	-
Aerosol vacuum	-	-	-
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	-
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414	Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use.
Block heater	Cole-Parmer	SBH130	-
BODIPY FL C5-ceramide	Thermo Scientific	D3521	To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation.
Crocodile clips and wires	-	-	-
Fiji/imageJ	National Institutes of Health, NIH	-	-
Fish medium, Fish water	-	-	Circulating system water collected from the fish facility.
Fish medium, E3 medium	-	-	E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water).
Fluorescence microscope	Leica	Leica MZ16F	Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable.
Glass needle	World Precision Instruments, Inc.	1B100-6	To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation.
Grass stimulator	Grass Instruments	S88	Stimulators of other kind are also expected to be suitable.
Kimwipes, Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	13258179	-
Laser scanning microscope (LSM)	Zeiss	Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880	LSM of other kind are also expected to be suitable.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate	Thermo Scientific	140675	-
Objective, 20×/1.0W water immersion	Zeiss	-	-
Pasteur Pipette, Graduated 1 mL	Starlab Group	E1414-0100	-
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL	Starlab Group	E1414-1100	-
Petri dish, 60 mm	Sigma-Aldrich	P5481	-
Plasmid, CMV-Cerulean	Christina L. Hammond (University of Bristol)		pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage.  Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAX	Henry Roehl (University of Sheffield)	-	For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage.
Pulse Controller	Hoefer Scientific Instruments	PC750	-
Soldering iron	-	-	-
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521	Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM.
Volocity	Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc	-	-
Watchmaker forceps, No. 5	-	-	-
Wire, Platinum	Goodfellow	PT005142/12	0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver.
Wire, Silver	Acros Organics	317730010	0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results).
Zebrafish, myog:H2B-mRFP	David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute)	-	ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX	Peter D. Currrie (ARMI, Monash University)	-	ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP	-	-	ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
ZEN software	Zeiss	-	-