Селективная деполяризация аксональных митохондрий с помощью микрофлюидики

Резюме

Настоящий протокол описывает посев и окрашивание нейронных митохондрий в микрофлюидных камерах. Градиент псевдоожиженного давления в этих камерах позволяет селективно обрабатывать митохондрии в аксонах для анализа их свойств в ответ на фармакологические проблемы, не влияя на компартмент клеточного тела.

Аннотация

Митохондрии являются основными поставщиками АТФ (аденозинтрифосфата) в нейронах. Митохондриальная дисфункция является распространенным фенотипом при многих нейродегенеративных заболеваниях. Учитывая сложную архитектуру некоторых аксонов и их чрезвычайную длину, неудивительно, что митохондрии в аксонах могут испытывать различные среды по сравнению с их аналогами клеточного тела. Интересно, что дисфункция аксональных митохондрий часто предшествует воздействию на организм клетки. Для моделирования аксональной митохондриальной дисфункции in vitro микрофлюидные устройства позволяют лечить аксональные митохондрии, не затрагивая сомальные митохондрии. Градиент псевдоожиженного давления в этих камерах предотвращает диффузию молекул против градиента, что позволяет анализировать свойства митохондрий в ответ на локальные фармакологические проблемы в аксонах. Текущий протокол описывает посев диссоциированных нейронов гиппокампа в микрофлюидные устройства, окрашивание мембранно-потенциально чувствительным красителем, лечение митохондриальным токсином и последующий микроскопический анализ. Этот универсальный метод изучения аксональной биологии может быть применен ко многим фармакологическим возмущениям и показаниям изображений и подходит для нескольких нейронных подтипов.

Введение

Митохондрии являются основными поставщиками АТФ (аденозинтрифосфата) в нейронах. Поскольку здоровье нейронов тесно связано с митохондриальной функцией, неудивительно, что дисфункциональная регуляция этих органелл была связана с началом различных нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона¹. Кроме того, митохондриальная интоксикация успешно используется для моделирования симптомов паркинсонизма у животных². Как на животных моделях, так и при болезни человека гибель нейронов начинается с дистальных частей ^3,4, намекая на то, что аксональные митохондрии могут быть более восприимчивы к оскорблениям. Однако биология митохондрий в аксонах недостаточно изучена из-за трудностей, связанных с целенаправленной обработкой и анализом аксональных митохондрий без одновременного нарушения процессов клеточного организма.

Последние достижения в методах культивирования диссоциированных нейронов in vitro теперь позволяют проводить жидкостное разделение аксонов и клеточных тел с помощью микрофлюидных устройств⁵. Как показано на рисунке 1A, эти устройства имеют четыре колодца доступа (a/h и c/i) с двумя каналами, соединяющими каждую пару (d и f). Большие каналы соединены друг с другом серией микроканалов длиной 450 мкм (e). Преднамеренные различия в уровнях заполнения между двумя камерами создают градиент давления жидкости (рисунок 1B), который предотвращает диффузию малых молекул из канала с более низким уровнем жидкости на другую сторону (рисунок 1C, проиллюстрированный синим красителем Трипана).

Недавно мы использовали микрофлюидные устройства для изучения требований к локальному переводу в аксональной митофагии, селективного удаления поврежденных митохондрий⁶. В настоящем протоколе представлены различные этапы индуцирования локального повреждения митохондрий путем селективной обработки аксонов с использованием ингибитора митохондриального комплекса III Антимицина А ^6,7.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами правительства Верхней Баварии. Первичные нейроны были получены из эмбрионов мышей дикого типа E16.5 C57BL/6 обоих полов в соответствии со стандартными методами, как^{описано ранее 6}.

1. Сборка микрофлюидного устройства

1. Покрыть одну шестилуночную пластину для культивирования тканей со стеклянным дном с конечной концентрацией 20 мкг/мл поли-D-лизина и 3,4 мкг/мл ламинина в PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор) (см. Таблицу материалов).
2. Инкубировать покрытую пластину на ночь в темноте при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие также может быть выполнено при 37 °C в течение 1-2 ч. Выбор покрытия зависит от типа используемой ячейки.
3. После нанесения покрытия поднесите шестилуночные пластины к стерильному вытяжке и дважды промыть их стерильным ddH₂O.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не промывайте солесодержащими буферами, такими как PBS, так как кристаллы соли будут препятствовать образованию уплотнения.
4. Дайте тарелке высохнуть в наклонном положении в течение 3-5 мин. Удалите лишнюю воду вакуумным всасыванием или пипеткой.
5. Замочите микрофлюидную камеру в 80% этаноле.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидная камера была получена из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).
6. Дайте микрофлюидной камере высохнуть в течение 3-5 мин в наклонном положении. Удалите избыток этанола вакуумом, всасыванием или пипеткой.
7. Когда полностью высохнет, поместите микрофлюидную камеру в центр лунки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Формирование уплотнения можно наблюдать как изменение отражающих свойств при исключении воздуха из границы раздела между пластиной и силиконовым устройством. Как пластина, так и микрофлюидная камера должны быть полностью сухими перед сборкой, чтобы создать хорошее уплотнение. Однако время высыхания должно быть максимально сведено к минимуму, чтобы обеспечить правильное прилипание к клеткам. Поэтому скважины и камеры должны быть визуально осмотрены на наличие оставшихся капель жидкости. Если капель не видно, немедленно соберите камеры.
8. Осторожно постучите по микрофлюидной камере по ее границам и микрогрузовой секции посередине для правильного крепления к стеклянной пластине.

2. Посев и поддержание нейронов

1. Соберите желаемое количество диссоциированных нейронов гиппокампа на камеру в реакционной трубке объемом 1,5 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования 1,5 х 10⁵ нейронов были посеяны на устройство для приложений на основе визуализации.
2. Центрифужные нейроны при 1000 х г в течение 4 мин при комнатной температуре.
3. Выбрасываем супернатант пипеткой и повторно суспендируем гранулу в 8 мкл B27-нейробазальной среды (см. Таблицу материалов).
4. Пипетка клеточного раствора в канал входа микрофлюидной камеры (b на фиг.1A).
5. Нажмите на заднюю часть пластины, чтобы помочь потоку через канал.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Постукивание может быть сделано довольно сильно, не беспокоясь о том, что пломба сломается.
6. Аспирировать с пипеткой любую оставшуюся клеточную суспензию на выходе из канала (g на фиг.1А) для уменьшения количества ячеек вне канала.
7. Инкубируют микрофлюидную камеру с клетками в течение 15-20 мин при 37 °C и 5% CO_2.
8. Заполните верхний аксональный колодец 50 мкл B27-нейробазальной среды (c на рисунке 1A).
9. Нажмите на заднюю часть пластины, чтобы помочь потоку через канал.
10. Заполните колодцы со стороны сомы (a и h на рисунке 1A) 150 мкл B27-нейробазальной среды каждая, создавая пузырь натяжения сверху. Объем пузыря составляет около 20 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Создание пузырька натяжения не является необходимым для достижения жидкостной изоляции, но оно обеспечивает четкое визуальное представление о большем объеме на стороне сомы.
11. Заполните обе лунки аксональной стороны (c и i на рисунке 1A) 100 мкл B27-нейробазальной среды каждая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для стимулирования роста аксонов через микрорезы рекомендуется, чтобы скважины на стороне сомы содержали больше сред, чем скважины на стороне аксона. Однако аксоны случайно будут расти через микрорезы даже без перепадов объема.
12. Инкубируют микрофлюидную камеру при 37 °C и 5% CO₂ в течение 7-8 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рост аксонов в аксональную камеру обычно можно наблюдать, начиная с дня in vitro (DIV) 5. Более длительные сроки культивирования возможны, если желательны более зрелые культуры.
13. Подкармливайте нейроны каждые 2-3 дня, удаляя среду из двух верхних лунок (a и c) и заменяя ее свежей B27-нейробазальной средой до образования пузырька напряжения.

3. Окрашивание чувствительным к потенциалу митохондриальной мембраны красителем

1. На DIV 7-8 оцените, что аксоны выросли через микрогрозы и простираются в аксональный отсек под световым микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Различные стадии DIV также возможны в зависимости от желаемого возраста.
2. Выполните две промывки предварительно нагретой средой визуализации (37 °C), удалив B27-нейробазальную среду из всех скважин и добавив около 100 мкл среды визуализации в верхние скважины как аксонального, так и сомального каналов (a и c). Пусть среда течет в нижние скважины (h и i).
   1. Удалите среду из нижних скважин и любую оставшуюся среду в верхних скважинах и повторите со свежей средой, оставив колодцы пустыми в конце промывки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за высокой капиллярной силы в каналах (d и f) в каналах останется промывочная среда, которую не следует удалять, чтобы предотвратить высыхание нейронов. Здесь может быть использована любая среда визуализации без фенола и красного цвета, например, Hibernate E (см. Таблицу материалов). Если микроскоп не оснащен источником CO₂ , убедитесь, что в среде визуализации используется альтернативная буферная система для карбоната/CO₂ (например, HEPES)⁸.
3. Разбавить 1 мМ тетраметилродамина этилового эфира (TMRE, красный, см. Таблицу материалов) до 5 нМ в среде визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 1% ДМСО в конечном разведении во избежание токсичности.
4. Добавьте 100 мкл разбавления TMRE 5 нМ как в соматическую, так и в аксональную верхние скважины (a и c) и дайте среде течь как через соматический, так и аксональный отсеки до тех пор, пока во всех скважинах не будет равного объема. Заполните TMRE-содержащей средой.
5. Поместите нейроны обратно в камеру контролируемой среды (37 °C и 5% CO₂) на 25 мин.
6. Выполните две промывки предварительно нагретой средой для визуализации (37 °C), как описано выше (шаг 3.2). При последней промывке заполняют по 100 мкл в каждой скважине и создают пузырь натяжения среды на соматических скважинах (a и c).

4. Визуализация живых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Показанные неподвижные изображения были получены на конфокальном микроскопе со вращающимся диском с использованием 40-кратного иммерсионного объектива NA 1.25 (см. Таблицу материалов). Было выбрано время экспозиции 200 мс и мощность лазера 10% для красного канала и время экспозиции 500 мс для яркого поля. Тем не менее, обычные конфокальные или широкоугольные инвертированные микроскопы также могут быть использованы для изучения интенсивности TMRE.

1. Визуализируйте клетки с помощью инвертированного микроскопа.
2. Убедитесь, что микроскоп оснащен сценическим инкубатором для поддержания нейронной культуры при 37 °C на протяжении всего эксперимента.
3. Выберите интересующую область в соматическом отсеке и проследуйте за ней через микропараты в аксональный отсек. Убедитесь, что изображенные микрорезы соответствуют тем, которые находятся в соматическом и аксональном компартментах (для более легкого сравнения исходного уровня и после обработки).
4. Захват флуоресцентных изображений с использованием возбуждения при 561 нм и излучения при 625 нм для красного флуоресцентного сигнала.
5. Получите изображения.
6. Чтобы индуцировать митохондриальную деполяризацию, добавьте 20 мкМ антимицина А (см. Таблицу материалов) в среде визуализации в аксональный компартмент. Чтобы обеспечить разность объемов между сомовой и аксональной камерами, проверьте наличие натяжного пузырька на соматической стороне (равен объему >110 мкл).
   1. Удалите всю среду визуализации из нижнего колодца аксональной стороны (i), за исключением среды внутри канала (f). Добавьте 160 мкл 20 мкМ антимицина А в верхнюю аксональную скважину (c) и дайте ему течь через канал до тех пор, пока в обеих аксональных скважинах не будет равного объема. Объемы в аксональных скважинах составляют примерно 80 мкл на скважину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что объем в аксональных скважинах меньше, чем в соматических скважинах, чтобы обеспечить надлежащее давление жидкости. Рекомендуется разница не менее 10 мкл (10% от объема скважины), но возможны и более высокие различия.
7. Инкубировать нейроны в камере контролируемой среды (37 °C) в течение 20-30 мин.
8. Повторите визуализацию, как описано выше (шаги 4.3-4.5). Убедитесь, что изображены те же позиции (легко идентифицируемые микропаровками), что и во время базового сбора.

Результаты

Первичные нейроны гиппокампа выращивали в микрофлюидных устройствах в течение 7-8 дней, прежде чем митохондрии окрашивали мембранно-чувствительным красителем (TMRE) в течение 25 мин в обоих каналах. Как показано на рисунке 2А, это привело к однородному окрашиванию митохонд?...

Обсуждение

Настоящий протокол описывает способ посева и культивирования диссоциированных нейронов гиппокампа в микрофлюидном устройстве для отдельного лечения аксональных митохондрий. Полезность этого подхода с мембранно-чувствительным красителем TMRE и комплексным ингибитором III Антимицином...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well Glass bottom plate	Cellvis	P06.1.5H-N	Silicone device
Antimycin A	Sigma	A8674
B27	Gibco	17504044
EVOS M5000 widefield microscope	Thermofischer Scientific	EVOS M5000	fully integrated digital widefield microscope
Hibernate E	BrainBits	HE500
Inverted spinning disk confocal	Nikon	TI2-E + CSU-W1	With incubator chamber
Laminin	Invitrogen	L2020
Microfluidic devices	XONA microfluidics	RD450
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Poly-D-Lysine	Sigma	P2636
TMRE	Sigma	87917