Анализ проточной цитометрии гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников костного мозга мышей и стромальных нишевых клеток

Резюме

Здесь мы описываем простой протокол выделения и окрашивания клеток костного мозга мышей для фенотипа гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников вместе с поддерживающими нишевыми эндотелиальными и мезенхимальными стволовыми клетками. Также включен метод обогащения клеток, расположенных в эндостальных и центральных областях костного мозга.

Аннотация

Костный мозг (БМ) - это мягкие ткани, обнаруженные в костях, где в первую очередь происходит кроветворение, процесс, посредством которого образуются новые клетки крови. Таким образом, он содержит гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники (HSPC), а также поддерживающие стромальные клетки, которые способствуют поддержанию и регуляции HSPC. Гематологические и другие нарушения КМ нарушают кроветворение, воздействуя непосредственно на гемопоэтические клетки и/или через изменение ниши КМ. Здесь мы описываем метод изучения гемопоэза в норме и злокачественных новообразований с помощью фенотипического анализа БМ мышей HSPC и популяций стромальных ниш с помощью проточной цитометрии. В нашем методе подробно описаны необходимые шаги для обогащения клеток БМ в эндостальных и центральных фракциях КМ, а также соответствующие стратегии стробирования для идентификации двух ключевых типов нишевых клеток, участвующих в регуляции HSPC, эндотелиальных клеток и мезенхимальных стволовых клеток. Предложенный здесь фенотипический анализ может быть объединен с мутантами мышей, моделями заболеваний и функциональными анализами для характеристики компартмента HSPC и его ниши.

Введение

Проточная цитометрия является бесценным методом для характеристики и проспективного выделения иммунных и кроветворных клеток. Он также все чаще используется для анализа стромальных и эпителиальных популяций различных тканей. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) обладают уникальными свойствами самообновления и мультипотентности. У взрослых млекопитающих ГСК в основном находятся в костном мозге (БМ), где они получают сигналы покоя и выживания из окружающей микросреды или ниши¹. ГСК формально определяются в соответствии с функциональными анализами². Тем не менее, несколько знаковых работ показали полезность проточной цито....

протокол

Животные, использованные в этом протоколе, были размещены на животноводческом объекте i3S в определенных условиях, свободных от патогенов, в 12-часовом цикле свет-темнота и в среде с контролируемой температурой. Был обеспечен свободный доступ к стандартному корму для грызунов и воде. Все животные получали гуманный уход в соответствии с критериями, изложенными Федерацией европейских ассоциаций лабораторных животных по уходу и обращению с лабораторными животными (Директива ЕС 2010/63/ЕС). Экспериментальная процедура, проведенная на животных (эвтаназия), была одобрена Комитетом по этике животных i3S (ссылка DD_2019_15) и Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. Подроб....

Результаты

Репрезентативные графики проточного цитометрического анализа ГСК и МПП у здоровой молодой взрослой мыши C57Bl/6 показаны на рисунке 1. Стратегия стробирования соответствует последней гармонизирующей номенклатуре, предложенной ISEH¹³. При анализе воздействия в.......

Обсуждение

Хотя описанный протокол прост и удобен в исполнении, особое внимание следует уделить конкретным шагам. Например, при получении промытого БМ (этап 5.2) не следует превышать объем или количество раз, указанное для прохождения PBS 2% FBS через внутреннюю часть центральной части кости, так как эт.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody	BioLegend	116114
APC Streptavidin	BioLegend	405207
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody	BioLegend	105826
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody	BioLegend	103116
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody	BioLegend	116223
Biotin anti-mouse CD3ε antibody	BioLegend	100304
Biotin anti-mouse CD4 antibody	BioLegend	100404
Biotin anti-mouse CD8a antibody	BioLegend	100704
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody	BioLegend	108404
Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody	BioLegend	116204
Biotin anti-mouse/human CD11b antibody	BioLegend	101204
Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody	BioLegend	103204
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody	BioLegend	115929
Calibrite 2 Color Beads	BD Biosciences	349502
Collagenase IV	Merck Life Science	C1889
Dispase II	Merck Life Science	D4693
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin	ThermoFisher Scientific	10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14175095
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody	R&D systems	BAF497
NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI)	ThermoFisher Scientific	R37606	DAPI reagent
PE anti-mouse endomucin antibody	ThermoFisher Scientific	12-5851-82
PE anti-mouse Flk2 (CD135)	ThermoFisher Scientific	12-1351-82
PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody	BioLegend	102524
PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody	BioLegend	103424
PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody	BioLegend	108122
Phosphate-buffered saline (PBS) tablets	Merck Life Science	P4417
Purified anti-mouse CD16/32 antibody	BioLegend	101302
RBC lysis buffer 10x	BioLegend	420302
Zombie Violet Fixable Viability Dye	BioLegend	423114	fluorescent dye