Применение проточной вермиметрии для количественной оценки и анализа микробиома кишечника Caenorhabditis elegans

Резюме

Caenorhabditis elegans является мощной моделью для изучения молекулярных детерминант, управляющих взаимодействием между хозяином и микробиомом. Мы представляем высокопроизводительный конвейер, профилирующий уровни колонизации микробиома кишечника у отдельных животных, а также ключевые аспекты физиологии C. elegans.

Аннотация

Состав микробиома кишечника может оказывать существенное влияние на физиологию хозяина на протяжении всего развития и жизни животного. Измерение изменений состава микробиома имеет решающее значение для выявления функциональных взаимосвязей между этими физиологическими изменениями. Caenorhabditis elegans стал мощной системой хозяина для изучения молекулярных факторов взаимодействия микробиома хозяина. Благодаря прозрачному строению тела и флуоресцентным меткам естественных микробов, относительные уровни микробов в микробиоме кишечника отдельного животного C. elegans могут быть легко количественно определены с помощью большого сортировщика частиц. В этой статье мы опишем процедуры экспериментальной настройки микробиома, сбора и анализа популяций C. elegans на желаемой стадии жизни, эксплуатации и обслуживания сортировщика, а также статистического анализа полученных наборов данных. Мы также обсудим соображения по оптимизации настроек сортировщика на основе интересующих микробов, разработку эффективных стратегий стробирования для этапов жизни C. elegans и то, как использовать возможности сортировщика для обогащения популяций животных на основе состава микробиома кишечника. В рамках протокола будут представлены примеры потенциальных приложений, в том числе потенциал масштабируемости для приложений с высокой пропускной способностью.

Введение

Эволюция животных находится под постоянным микробным влиянием¹. Из разнообразных микробов в окружающей среде животные-хозяева приобретают специфических^{партнеров2} , которые расширяют возможности хозяина и управляют его физиологией и восприимчивостью к болезням³. Например, метагеномный анализ микробиома кишечника выявил обогащенные метаболические классы микробных генов, которые могут обеспечить больший сбор и хранение энергии у мышей с ожирением⁴, многие из которых также обнаружены в микробиоме кишечника человека⁵. По-прежнему сущ....

протокол

1. Приготовление смеси микробиома

1. Выдавите или выдавите бактерии из глицериновой морозильной камеры на тарелку для лизогенного бульона (LB) или соответствующую питательную среду и выращивайте в течение ночи при оптимальной температуре в зависимости от интересующих штаммов бактерий (обычно 25 °C для естественных микробов C. elegans ).
2. Используя одну колонию из каждого бактериального изолята (например, 12 бактерий из коллекции CeMbio) для посева 800 мкл среды LB в отдельные лунки глубоколунной пластины объемом 1 мл. Инкубируют в течение ночи при оптимальной температуре при встряхивании при 250 оборотах в минуту.
   ПРИМЕЧАНИ....

Результаты

Определение ворот популяции взрослых особей и личинок
Здесь синхронизированные C. elegans L1 выращивали на планшете NGM, засеянном E. coli OP50 (Eco), стандартной лабораторной диетой. Популяции C. elegans собирали для анализа ЛПС через 96 ч или 120 ч роста при 20 °C (рис. 2А

Обсуждение

В нескольких исследованиях для характеристики генов и путей C. elegans против колонизации и токсичности патогенов использовалась проточная вермиметрия^21,22. Здесь представлен высокопроизводительный подход, который использует C. elegans для изучения то.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical bottom centrifuge tubes	VWR	10026-076
96 deep-well plates (1 mL)	Axygen	P-DW-11-C
96 deep-well plates (2 mL)	Axygen	P-DW-20-C
96-well Costar plate	Corning	3694
Agar	Millipore Sigma		Standard bacteriology agar is also sufficient.
Aspirating manifold	V&P scientific	VP1171A
Bleach	Clorox
Bleach solution			Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)
Cell Imaging Multimode Reader	Biotek	Cytation 5	Bacterial OD measurement
Centrifuge	Thermo scientific	Sorvall Legend XTR	For 96 well plate and conical tubes
Fluorescent Microscope	Nikon	TiE
ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.	R package	Version 3.3.2
Large Particle Autosampler	Union Biometrica	LP Sampler
Large Particle Sorter	Union Biometrica	COPAS Biosorter
Levamisole	Fisher	AC187870100
Lysogeny Broth (LB)	RPI	L24066	Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.
M9 solution			22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode Growth Medium	RPI	N81800-1000.0	1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.
RStudio	GNU	Version 1.3.1093
Sodium hypochlorite	Sigma-Aldrich		5M NaOH
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745
Sterile 10 cm diameter petri dishes	Corning	351029
Sterile 12-well plates	VWR	10062-894
Sterile 24-well plates	VWR	10062-896
Sterile 6 cm diameter petri dishes	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787