Генерация модели спонтанного аутоиммунного тиреоидита мыши

Резюме

Было установлено несколько типов животных моделей тиреоидита Хашимото, а также спонтанного аутоиммунного тиреоидита у мышей NOD. Мыши H-2h4 являются простой и надежной моделью для индукции HT. В этой статье описан этот подход и оценен патологический процесс для лучшего понимания мышиной модели SAT.

Аннотация

В последние годы тиреоидит Хашимото (ГТ) стал наиболее распространенным аутоиммунным заболеванием щитовидной железы. Характеризуется инфильтрацией лимфоцитов и выявлением специфических сывороточных аутоантител. Хотя потенциальный механизм до сих пор не ясен, риск тиреоидита Хашимото связан с генетическими факторами и факторами окружающей среды. В настоящее время существует несколько типов моделей аутоиммунного тиреоидита, включая экспериментальный аутоиммунный тиреоидит (EAT) и спонтанный аутоиммунный тиреоидит (SAT).

EAT у мышей является распространенной моделью ГТ, которая иммунизируется липополисахаридом (ЛПС) в сочетании с тиреоглобулином (Tg) или дополняется полным адъювантом Фройнда (CFA). Модель мыши EAT широко распространена на многих типах мышей. Однако прогрессирование заболевания, скорее всего, связано с ответом антител Tg, который может варьироваться в разных экспериментах.

SAT также широко используется при изучении ГТ в НОД. Мышь H-2h4. НОД. Мышь H2h4 - это новый штамм, полученный в результате скрещивания мыши с диабетом без ожирения (NOD) с B10. A (4R), который значительно индуцируется для ГТ с питанием йодом или без него. Во время индукции НОД. Мышь H-2h4 имеет высокий уровень TgAb, сопровождающийся инфильтрацией лимфоцитов в фолликулярной ткани щитовидной железы. Однако для этого типа мышиной модели существует мало исследований, позволяющих всесторонне оценить патологический процесс при индукции йода.

В этом исследовании установлена модель мыши SAT для исследования ГТ, и патологический процесс изменения оценивается после длительного периода индукции йода. С помощью этой модели исследователи могут лучше понять патологическое развитие ГТ и выявить новые методы лечения ГТ.

Введение

Тиреоидит Хашимото (ГТ), также известный как хронический лимфоцитарный тиреоидит или аутоиммунный тиреоидит, был впервые зарегистрирован в 1912 году¹. ГТ характеризуется инфильтрацией лимфоцитов и повреждением фолликулярной ткани щитовидной железы. Лабораторные тесты в основном проявляются в повышении специфических антител к щитовидной железе, включая антитела к тиреоглобулину (TgAb) и антитела к тиреоидной пероксидазе (TPOAb)². Заболеваемость ГТ находится в диапазоне 0,4-1,5%, что составляет 20-25% всех заболеваний щитовидной железы, и это значение увеличилось в последние годы³. Кроме того, в большом количестве исследований сообщалось, что ГТ связана с онкогенезом и рецидивом папиллярной карциномы щитовидной железы (ПТК)^4,5; Потенциальные механизмы до сих пор остаются спорными. Аутоиммунный тиреоидит также является важным фактором женского бесплодия⁶. Следовательно, патогенез ГТ должен быть ясным, для чего необходима стабильная и простая животная модель.

Для изучения этиологии ГТ были использованы два основных вида мышиных моделей, включая экспериментальный аутоиммунный тиреоидит (EAT) и спонтанный аутоиммунный тиреоидит (SAT) в настоящих исследованиях ^7,8. Восприимчивых мышей иммунизировали специфическими антигенами щитовидной железы (включая сырую щитовидную железу, очищенный тиреоглобулин [ТГ], тиреоидную пероксидазу [ТПО], рекомбинантный эктодомен ТПО и выбранные пептиды ТПО) для создания мышиной модели EAT. Кроме того, адъюванты, в том числе липополисахарид (ЛПС), полный адъювант Фройнда (CFA) и другие необычные адъюванты, также используются во время иммунизации для нарушения иммунной толерантности 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Модель SAT является важной моделью для изучения спонтанного развития аутоиммунного тиреоидита, в основе которого лежит NOD. Мыши H-2h4. НОД. Мышь H-2h4 - это новый штамм, полученный в результате скрещивания NOD и B10. Мыши A(4R) с последующим множественным обратным скрещиванием с NOD с геном предрасположенности к аутоиммунному тиреоидиту IAk^18,19. КИВОК. У мышей H-2h4 диабет не развивается, но отмечается высокая заболеваемость аутоиммунным тиреоидитом и синдромом Шегрена (SS)¹⁹. Исследования показали, что молекула внутриклеточной адгезии-1 (ICAM-1) высоко экспрессируется в ткани щитовидной железы NOD. Мыши H-2h4 в возрасте 3-4 недель. Более того, с увеличением потребления йода усиливается иммуногенность молекулы тиреоглобулина, что еще больше повышает экспрессию ICAM-1, играющего важную роль в процессе инфильтрации моноцитов²¹. Эта модель имитирует аутоиммунный процесс, проверяя взаимосвязь между дозой йода и тяжестью заболевания. Установленный метод стабилен, с высокой вероятностью успеха. Модель SAT применяется для индуцирования аутоиммунного тиреоидита в течение многих лет и продолжает оставаться эффективным методом изучения патогенеза аутоиммунного тиреоидита. Однако нынешний метод построения модели EAT является более сложным и дорогим; В разных лабораториях используются разные методы иммунизации и места инъекций. Кроме того, мыши с разным генетическим фоном имеют разные показатели индукции, которые нуждаются в дальнейшем изучении, чтобы выявить мощный механизм.

Однако развитие тиреоидита в модели SAT связано с йодидом натрия, половым диморфизмом и условиями выращивания. Чтобы выявить соответствующую процедуру аутоиммунного тиреоидита в модели SAT, в этой статье описан метод индукции аутоиммунного тиреоидита при различных состояниях. Кроме того, это позволяет изучать патогенез и иммунологический прогресс аутоиммунного тиреоидита на разных стадиях этого заболевания.

протокол

Протокол, описанный ниже, был одобрен руководящими принципами по уходу и использованию, установленными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Сычуаньского университета.

1. Подготовка

1. Размещайте всех мышей в определенных условиях, свободных от патогенов, в течение 12-часовых циклов свет-темнота (начиная с 07:00 и 19:00 соответственно). Поддерживайте температуру в помещении на уровне 22 °C. Меняйте постельные принадлежности каждую неделю. Обеспечьте достаточное количество стандартного корма для грызунов и воды.
2. При приготовлении исходного раствора NaI в воде взвесьте 2,5 г соединения и растворите его в 50 мл стерильной чистой воды при вихретании, чтобы получить исходный раствор 5%. Храните этот исходный раствор в морозильной камере при температуре 4 °C, избегая света, до 8 недель.
3. Чтобы приготовить рабочий раствор NaI, наберите 2,5 мл исходного раствора и растворите его в 250 мл обычной воды в качестве ежедневной питьевой воды для NOD. Н-2н4 мышам, дать рабочий раствор 0,05%.

2. Индукция тиреоидита

1. Модель SAT
   1. Подготовьте НОД. Мышей H-2h4 (возраст 8 недель) для исследования путем размещения всех мышей одного пола (без полового диморфизма) в барьерных клетках (пять животных в клетке) с условиями кормления, описанными на шаге 1.1.
   2. Индуцировать аутоиммунный тиреоидит при НОД. Мышей H-2h4 кормите всех мышей 0,05% NaI в течение 8 недель. Меняйте воду NaI каждую неделю и еженедельно оценивайте состояние мышей, включая внешний вид, вес, аппетит, психическое состояние и подвижность.
2. Модель EAT
   1. Подготовьте мышей BALB/c (8-недельный возраст) к исследованию, разместив всех мышей одного пола (без полового диморфизма) в барьерных клетках (по пять животных в клетке) с условиями кормления, описанными на шаге 1.1. Кормите всех мышей 0,05% NaI в течение 8 недель.
   2. В течение первых 2 недель подкожно вводят смесь CFA и Tg (200 мкл) один раз в неделю.
   3. Начиная с третьей недели, подкожно вводят смесь ИФА и Тг (200 мкл) один раз в неделю в течение 3 недель.

3. Измерения

1. Подготовка образцов периферической крови
   1. После индукции обезболивают мышей объемом 0,01 мл/г анестетика внутрибрюшинной инъекцией. Приготовьте анестетик, смешав мидазолам (40 мкг/100 мкл для седации), медетомидин (7,5 мкг/100 мкл для седации) и тартрат буторфанола (50 мкг/100 мкл для обезболивания) в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные концентрации каждого компонента в анестезиологической смеси составляют: мидазолам 13,33 мкг / 100 мкл, медетомидин 2,5 мкг / 100 мкл и буторфанол 16,7 мкг / 100 мкл. Для конкретных дозировок, используемых на мышах, дозы: мидазолам 4 мкг / г, медетомидин 0,75 мкг / г и буторфанол 1,67 мкг / г. Глубина анестезии была подтверждена, когда мышцы конечностей мыши расслабились, усы не реагировали на прикосновения, и произошла потеря педального рефлекса.
   2. После того, как мыши будут анестезированы, подготовьте образцы периферической крови, зафиксировав мышь одной рукой и нажав на кожу глаза, чтобы выпячивать глазное яблоко. Затем вставьте капиллярную трубку во внутренний угол глаза и проникните под углом 30-45 градусов к плоскости ноздри. Надавите, осторожно вращая капиллярную трубку. Кровь будет поступать в трубку через капиллярное действие.
   3. Поместите кровь в холодильник с температурой 4 ° C на 2 часа, а затем центрифугу при 1000 × г в течение 10 минут при 4 ° C, чтобы получить образец. Для дальнейшего анализа храните остальную часть образца при температуре -80 °C.
2. Подготовка образцов ткани щитовидной железы
   1. Гуманно усыпить животное в соответствии с институциональной политикой. Затем рассеките стенку грудной клетки, чтобы обнажить сердце, разрежьте правое предсердие и введите физиологический раствор в левый желудочек с помощью внутривенной инфузионной иглы, прикрепленной к шприцу объемом 20 мл, пока ткань не станет белой.
   2. Закрепите мышь на диссекционном столе с помощью булавок. Стерилизуйте горлышко 75% этанолом. Разрежьте кожу мыши по срединной линии шеи от верхней части грудины до нижней челюсти тканевыми ножницами, чтобы полностью обнажить ткани шеи.
   3. Понаблюдайте за парой розовых желез, подчелюстными железами, под которыми находится передняя мышца трахеи. Разделите железы и мышцы глазными ножницами и щипцами, чтобы обнажить трахею и щитовидный хрящ.
   4. Отделите ткань под хрящом, используя изогнутые щипцы, чтобы собрать хрящ и трахею вместе. Разрежьте дистальный и проксимальный концы хряща и трахеи соответственно и удалите щитовидную железу вместе с трахеей.
   5. Погрузить железы в 4% параформальдегид на 12-24 ч. Затем переведите ткань на 70% этанол.
   6. Поместите отдельные доли биопсийного материала щитовидной железы в технологические кассеты и обезвоживайте через следующий последовательный градиент спирта: 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%, этанол в течение 40 мин каждый; 1/2 ксилола + 1/2 абсолютного этанола в течение 2 ч; 100% ксилол в течение 1,5 ч; 100% ксилол в течение 1,5 ч; 1/2 ксилола + 1/2 парафина на 2 ч; духовка при температуре 40°С в течение 40 мин; парафин I в течение 30 мин; и парафин II в течение 30 мин. Встройте их в блоки парафина.
   7. Перед окрашиванием депарафинируют срезы ткани щитовидной железы толщиной 5 мкм в ксилоле (как показано ниже) и регидратируют через следующие снижающиеся концентрации этанола: ксилол I в течение 10 мин; ксилол II в течение 10 мин; ксилол III в течение 10 мин; абсолютный этанол I в течение 5 мин; абсолютный этанол II в течение 5 мин; 90% спирт в течение 5 мин; 80% спирт в течение 5 мин; 70% спирт в течение 5 мин; и 50% спирт в течение 5 мин.
   8. Окрашивание тканей гематоксилином и эозином (H&E). Пятнить гематоксилином в течение 15 мин, промыть водопроводной водой в течение 15 мин, добавить 1% солянокислый этанол в течение 10 с, промыть проточной водой, а затем 50%, 70% и 80% этанолом каждый в течение 3 мин. Проведите окрашивание эозином эозином в течение 2 мин и смойте проточной водой. Поместите парафиновые секции последовательно в 75% этанол на 2 мин, 85% этанол на 2 мин, абсолютный этанол на 5 мин и ксилол на 5 мин. Закрепите срезы нейтральной резинкой и предметными стеклами.
   9. Чтобы оценить степень лимфоцитарного тиреоидита, оцените срезы щитовидной железы следующим образом: 0: незначительная инфильтрация лимфоцитов в ткани щитовидной железы или ее отсутствие; 1+: более 1/8 железы инфильтрировано в одном или нескольких очагах; 2+: не более 1/4 железы инфильтрировано лимфоцитами; 3+: 1/4-1/2 железы инфильтрировано лимфоцитами; 4+: разрушается более 1/2 железы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется удалить щитовидный хрящ, чтобы сохранить всю структуру щитовидной железы мыши, которая слишком мала для удаления из трахеи.
3. Измерение TPOAb
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки яичников китайского хомяка (CHO), стабильно экспрессирующие ТПО мыши, были созданы в нашей лаборатории. КДНК TPO мыши была удалена XbaI и NheI. Затем кДНК переносили на pcDNA5/FRT. После того, как плазмида была успешно построена, ее трансфицировали в клетки СНО и отбирали гигромицином B (100 г / мл).
   1. После построения клеток mTPO-CHO разбавьте сыворотки мыши из шага 3.1.3 (1:50) и инкубируйте с клетками mTPO-CHO в течение 2 часов. После инкубации исключите окрашивание клеток йодидом пропидия (1 г/мл) и проанализируйте образец методом проточной цитометрии с использованием флуоресцеин-изотиоцианат-конъюгированного, аффинно-очищенного козьего антимышиного IgG. Скрининг выживших одноклеточных популяций по каналам FSC-A и SSC-A и выбор клеток, помеченных FITC и PI, из одноклеточных популяций²¹.
   2. Включите сыворотку неиммунизированных мышей BALB/c или C57BL/6, связанных с IgG, в качестве отрицательного контроля. Включите мышиные моноклональные антитела к человеческому TPO²² в качестве положительного контроля, который распознает TPO²³ мыши. Выразите данные привязки ТПО в виде геометрических средств.
4. Измерение TgAb
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте набор для ИФА для обнаружения тиреоглобулина, следуя инструкциям производителя.
   1. Разведите стандартные образцы в микроцентрифужной пробирке согласно инструкции. Достаньте набор из холодильника и держите его при комнатной температуре в течение 30 минут.
   2. Установите стандартные скважины, пустые колодцы и испытательные скважины. Пустые скважины получают только буфер, в то время как стандартные скважины получают стандартные растворы. Добавьте 10 мкл образцов в испытательные лунки. При добавлении образцов старайтесь не касаться стенок лунок и осторожно встряхивайте пластину, чтобы переместить образцы на дно лунок.
   3. Включите сыворотку от мышей BALB/c, иммунизированных Tg, CFA и IFA²⁴ , в качестве положительного контроля и сыворотку от NOD 8-недельного ребенка. Мыши H-2h4 на обычной воде в качестве отрицательного контроля.
   4. Инкубируйте образцы на водяной бане при температуре 37 °C в течение 30 минут. Разбавьте моющий буфер дистиллированной водой в соотношении 1:30. Затем снимите герметизирующую пленку, стряхните жидкость внутри ферментной пластины, высушите на впитывающей бумаге и добавьте 350 мкл моющего буфера в течение 30 с. Повторите эту процедуру пять раз, а затем промокните лунки насухо.
   5. В каждую лунку, кроме глухих лунок, добавляют по 50 мкл ферментирующего реагента и выдерживают на водяной бане при 37° в течение 30 мин. Снимите герметизирующую пленку, стряхните жидкость внутри ферментной пластины и промокните насухо на впитывающей бумаге.
   6. Добавьте 50 мкл проявителя А в каждую лунку, а затем 50 мкл проявителя B и осторожно встряхните лунки для перемешивания в течение 5 минут. Добавьте 50 мкл раствора в каждую лунку в течение 15 мин, чтобы остановить реакцию. Измерьте коэффициент поглощения (OD) каждой лунки на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов. Представьте данные TgAb в виде оптической плотности (OD) на длине волны 490 нм.
5. Измерение Т4 и тиреотропного гормона (ТТГ)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте уровни Т4 и ТТГ (в аликвотах 10 мкл) с помощью ИФА, следуя инструкциям производителя.
   1. Разбавьте конъюгат фермента до 1:11 с разбавителем анализа; разбавить измеряемые образцы (1:100) с помощью 0,01 М PBS.
   2. Добавляют 10 мкл стандарта и образца в соответствующие лунки, добавляют по 100 мкл конъюгата фермента в каждую лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
   3. Слейте жидкость в лунки и трижды очистите ее промывочным буфером.
   4. Добавьте 100 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мин.
   5. Добавьте 50 мкл раствора и аккуратно перемешайте в течение 15-20 с.
   6. Определите коэффициент поглощения (OD) с помощью считывателя микропланшетов на длине волны 450 нм и рассчитайте концентрацию образца.
   7. Используйте статистическое программное обеспечение для выполнения t-критерия или теста ранговой суммы и построения графика результатов.

Результаты

Гистологические изменения разительно различались у женщин и мужчин, продолжительности приема йода и раствора NaI. Как показано на рисунке 1, ~ 10% NOD. У мышей H-2h4 развился SAT даже без индукции йода в возрасте 24 недель, и у всех мышей в конечном итоге развился тиреоидит. При регу...

Обсуждение

ГТ возникает из-за расстройства аутоиммунной системы, вызванного лимфоцитами, проникающими в щитовидную железу, что еще больше ухудшает функцию щитовидной железы, вырабатывая при этом специфические для щитовидной железы антитела. Уровни ТТГ, TgAb и TPOAb в сыворотке крови у пациентов с ГТ ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Butorphanol tartrate	Supelco	L-044
Dexmedetomidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well	Sigma-Aldrich	M9410-1CS
Ethanol	macklin	64-17-5
Freund’s Adjuvant, Complete	Sigma-Aldrich	F5881
Freund’s Adjuvant, Incomplete	Sigma-Aldrich	F5506
Goat anti-Mouse IgG	invitrogen	SA5-10275
Midazolam solution	Supelco	M-908
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA	Calbiotech	DKO045
Paraformaldehyde	macklin	30525-89-4
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4864
Sodium Iodine	Sigma-Aldrich	7681-82-5
Thyroglobulin	Sigma-Aldrich	T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit	Thermo Scientific	EHTGX5
TSH ELISA	Calbiotech	DKO200
Xylene	macklin	1330-20-7