JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает хирургическое воздействие на ганглий дорсального корешка (DRG) с последующим GCaMP3 (генетически кодируемый индикатор Ca2+ ; Зеленый флуоресцентный белок-кальмодулин-белок M13 3) Ca2+ визуализация нейронных ансамблей с использованием мышей Pirt-GCaMP3 при применении различных стимулов к ипсилатеральной задней лапе.

Аннотация

Визуализация Ca 2+ может быть использована в качестве прокси для клеточной активности, включая потенциалы действия и различные сигнальные механизмы, включающие проникновение Ca 2+ в цитоплазму или высвобождение внутриклеточных запасов Ca2+. ВизуализацияCa 2+ на основе Pirt-GCaMP3 первичных сенсорных нейронов ганглия дорсального корешка (DRG) у мышей дает преимущество одновременного измерения большого количества клеток. Можно контролировать до 1,800 нейронов, что позволяет изучать нейронные сети и соматосенсорные процессы как ансамбль в их нормальном физиологическом контексте на популяционном уровне in vivo. Большое количество контролируемых нейронов позволяет обнаруживать паттерны активности, которые было бы сложно обнаружить с помощью других методов. Стимулы могут быть приложены к задней лапе мыши, что позволяет изучать прямое воздействие стимулов на ансамбль нейронов DRG. Количество нейронов, продуцирующих переходные процессы Ca2+, а также амплитуда переходных процессовCa2+ указывает на чувствительность к определенным сенсорным модальностям. Диаметр нейронов свидетельствует об активированных типах волокон (безвредные механические и вредные болевые волокна, волокна Aβ, Aδ и C). Нейроны, экспрессирующие специфические рецепторы, могут быть генетически помечены td-Tomato и специфическими рекомбиназами Cre вместе с Pirt-GCaMP. Таким образом, визуализация PIRT-GCaMP3 Ca2+ DRG предоставляет мощный инструмент и модель для анализа специфических сенсорных модальностей и подтипов нейронов, действующих как ансамбль на популяционном уровне для изучения боли, зуда, прикосновения и других соматосенсорных сигналов.

Введение

Первичные сенсорные нейроны непосредственно иннервируют кожу и переносят соматосенсорную информацию обратно в центральную нервную систему 1,2. Ганглии дорсальных корешков (DRG) представляют собой скопления клеточных тел из 10 000-15 000 первичных сенсорных нейронов 3,4. Нейроны DRG имеют различный размер, уровни миелинизации и паттерны экспрессии генов и рецепторов. Нейроны меньшего диаметра включают нейроны, чувствительные к боли, а нейроны большего диаметра обычно реагируют на безболезненные механические стимулы 5,6. Нарушения в первичных сенсорных нейронах, такие как травма, хроническое воспаление и периферические невропатии, могут сенсибилизировать эти нейроны к различным раздражителям и способствовать хронической боли, аллодинии и гиперчувствительности к боли 7,8. Поэтому изучение нейронов DRG важно для понимания как соматочувствительности в целом, так и многих болевых и зудящих расстройств.

Нейроны, возбуждающиеся in vivo, необходимы для соматосенсации, но до недавнего времени инструменты для изучения интактных ганглиев in vivo были ограничены относительно небольшим количеством клеток9. Здесь мы описываем мощный метод изучения потенциалов действия или активности нейронов на популяционном уровне in vivo как ансамбля. В методе используется визуализация, основанная на цитоплазматической динамикеCa 2+. Чувствительные флуоресцентные индикаторы Ca 2+ являются хорошими прокси для измерения клеточной активности из-за обычно низкой концентрации цитоплазматического Ca2+. Эти показатели позволили одновременно контролировать от сотен до нескольких тысяч первичных сенсорных нейронов у мышей 9,10,11,12,13,14,15,16 и крыс 17. Метод визуализации in vivo Ca2+, описанный в этом исследовании, может быть использован для непосредственного наблюдения за реакциями популяционного уровня на механические, холодные, тепловые и химические раздражители.

Фосфоинозитид-связывающий мембранный белок Pirt экспрессируется на высоких уровнях почти во всех (>95%) первичных сенсорных нейронах18,19 и может использоваться для управления экспрессией датчика Ca 2+, GCaMP3, для мониторинга активности нейронов in vivo20. В этом протоколе описаны методы выполнения операции in vivo DRG, визуализации Ca2+ и анализа в правой поясничной зоне 5 (L5) DRG мышей Pirt-GCaMP314 с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (LSM).

протокол

Все описанные здесь процедуры были выполнены в соответствии с протоколом, утвержденным Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Центра медицинских наук Техасского университета в Сан-Антонио.

ПРИМЕЧАНИЕ: После начала операции на животных (шаг 1) и визуализация (шаг 2) должны выполняться непрерывно. Анализ данных (шаг 3) может быть выполнен позже.

1. Хирургическое вмешательство и обеспечение безопасности животного для визуализации L5 DRG с правой стороны

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались как самцы, так и самки мышей Pirt-GCaMP3 C57BL / 6J в возрасте 8 недель и старше. В то время как любой пол может быть изображен одинаково хорошо, мышам должно быть не менее 8 недель из-за слабой или прерывистой экспрессии Pirt у молодых мышей. Мыши Pirt-GCaMP3 C57BL/6J были получены в Университете Джона Хопкинса14. Можно визуализировать ДРГ с обеих сторон, а также другие поясничные ДРГ (например, поясничный 4). Указанное время является приблизительным для опытного хирурга. Случайные технические проблемы, такие как повышенное кровотечение, могут увеличить необходимое время.

  1. Приготовьте стерильный физиологический раствор, содержащий 40 мг/мл кетамина и 6 мг/мл ксилазина. Общий объем должен составлять не менее 9 мкл / г массы тела как для хирургического вмешательства, так и для эвтаназии после визуализации.
    ВНИМАНИЕ: Кетамин вреден при инъекции, проглатывании или при попадании в глаза. Обращайтесь с осторожностью.
  2. Убедитесь, что все хирургические инструменты чисты и стерилизованы автоклавированием или другим методом, одобренным Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных.
  3. За 15-25 минут до операции введите мыши Pirt-GCaMP3 внутрибрюшинно (внутривенно) ~ 2,25 мкл кетамина/ксилазина на каждый грамм массы тела (90 мг/кг кетамина, 13,5 мг/кг ксилазина). Не превышайте 120 мг/кг кетамина.
  4. В течение 15-25 минут после инъекции анестезии (этап 1.3) проверьте, достигла ли мышь хирургической плоскости анестезии, ущипнув контралатеральную заднюю лапу (а не ипсилатеральную/правую заднюю лапу). Отсутствие рефлекса отвода задних конечностей обеспечивает достижение хирургической плоскости анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рефлекс отвода задних конечностей используется на протяжении всего эксперимента для контроля анестезии. Всегда используйте контралатеральную заднюю лапу.
  5. Поместите мышь на грегретый коврик, чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть полезно удерживать голову мыши на месте с помощью стереотаксической рамки (см. Таблицу материалов) или другой рамки в зависимости от предпочтений исследователя.
  6. Найдите увеличение поясницы, нащупав тазовую кость мыши. Побрейте заднюю часть мыши над областью увеличения поясницы. Этот шаг должен занять ~90 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь можно ненадолго снять с грелки для бритья.
  7. Сделайте трехсторонний прямоугольный разрез (8 мм x 20 мм) над поясничным увеличением с помощью ножниц и сложите кожу щипцами (рис. 1A). Этот шаг занимает ~2 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователи могут также использовать гемостатные щипцы или ретрактор, чтобы держать разрез открытым. Это не операция на выживание, поэтому дополнительная очистка хирургической области не требуется; Однако это можно сделать с помощью повидон-йода. Здесь приведен максимально допустимый размер разреза. Меньший разрез предпочтительнее, чем больший разрез.
  8. Используйте ножницы для рассечения пружины 13 мм, чтобы сделать разрезы 3-4 мм на правой стороне позвоночника. Используйте ножницы, чтобы разрезать кожу и мышцы в стороны, чтобы обнажить позвоночник (рис. 1B). Этот шаг занимает ~3 мин.
  9. Используйте 8-миллиметровые ножницы, чтобы очистить поперечный отросток правой стороны L5 DRG, отрезав мышцу и соединительную ткань, пытаясь свести к минимуму кровотечение. Используйте вату и/или гелевую пену для впитывания крови. Позвонок L5 является первым ростральным позвонком тазовой кости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает ~ 3 минуты и может занять дополнительное время, если животное кровоточит больше, чем обычно.
  10. Разрежьте правый поперечный отросток L5 с помощью ронгеров Фридмана-Пирсона или крепких тонких щипцов. Будьте осторожны, чтобы не прикоснуться к DRG (рис. 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает ~ 2 минуты, но может занять дополнительное время, если животное кровоточит больше, чем обычно.
  11. Не продолжайте до полной остановки кровотечения. Предотвратите кровотечение на поверхности DRG с помощью гелевой пены или ваты. Этот шаг занимает 1-4 минуты.
  12. Переместите мышь и грелку на пользовательский столик (рис. 2A, B). Используйте сценическую ленту, чтобы закрепить животное и грелку на месте. Поместите нос животного в носовой конус, чтобы животное могло получать непрерывную изофлурановую анестезию. Закрепите правую заднюю лапу, торчащую из сцены, чтобы стимулы можно было легко приложить к лапе. Этот шаг занимает 3 минуты.
  13. Закрепите позвоночник на месте с помощью ступенчатых зажимов на коже на позвонках и/или тазовой кости только рострально и каудально по отношению к L5 DRG. Отрегулируйте зажимы и ступень так, чтобы поверхность DRG была как можно более ровной (рис. 2B, C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться обрезать ткань, лежащую между DRG и объективом.
  14. Поместите предметный столик под микроскопом так, чтобы объектив находился на 8 мм непосредственно над DRG в опущенном состоянии (рис. 3A, B). Вставьте ректальный термометр.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние от DRG до объектива может варьироваться в зависимости от объектива, микроскопа и животного.
  15. Подключите линии электропередач к грелке и ректальному термометру. Подсоедините носовой обтекатель к газовым магистралям изофлурана.

figure-protocol-6220
Рисунок 1: Пример операции по облучению DRG . (А) Небольшой участок был сбрит, а кожа разрезана и сложена. Разрез ~10 мм по рострально-каудальной оси. (B) Был сделан разрез на правой стороне позвоночника, и мышцы и соединительная ткань были отрезаны, обнажив поперечный отросток правой стороны L5. Кровь впитывалась с помощью пенопласта. (C) Поперечный отросток был очищен и кость над DRG была удалена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-7050
Рисунок 2: Установка мыши на пользовательский столик для создания изображений DRG . (A) Показан пользовательский этап. Он состоит из опорной плиты и пластины для животного. Монтажная пластина для животных находится на стопорном шаровом и шарнирном шарнирном соединении. Носовой обтекатель с линиями подачи смеси кислорода / изофлурана и линия отходящих газов вместе с грелкой, обернутой алюминиевой фольгой, приклеены к монтажной пластине животного. Два рычага, каждый из которых состоит из трех шарнирных шарнирных соединений с фиксатором, крепятся болтами к опорной плите. На каждой руке есть зажим из щипцов с винтом для затягивания и ослабления. (B) Животное закреплено на монтажной пластине животного. Его нос помещен в носовой обтекатель. Зажимы накладываются на кожу, удерживающую позвоночник и тазовую кость. Правая (ипсилатеральная) задняя лапа заклеена скотчем, чтобы торчать для легкого доступа для применения стимулов. (C) Изображение крупным планом зажатого позвоночника и тазовой кости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-8478
Рисунок 3: Животное на пользовательском столике размещено под объективом микроскопа . (A) Широкоугольный вид предметного столика, животного и микроскопа. Слева видны провода к регулятору температуры постоянного тока и линии к забору кислорода/изофлурана и линии отходящих газов. (B) Крупный план животного под объективом микроскопа. ДРГ находится на ~8 мм ниже объектива. Ректальный термометр вставляется, и нос находится внутри носового конуса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Визуализация DRG

  1. Для получения изображений используйте вертикальный конфокальный микроскоп 10x/0.4 DIC и соответствующее программное обеспечение (см. Таблицу материалов). Используйте настройки зеленого фильтра (FITC): возбуждение 495 нм, излучение 519 нм, длина волны детектирования 500-580 нм, устройство визуализации GaAsP-Pmt1, детектор GaAsP-PMT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для других микроскопов используйте настройки, рекомендованные производителем.
  2. Найдите поверхность ДРГ с помощью микроскопа. Отрегулируйте зажимы на столике таким образом, чтобы поверхность DRG была как можно более ровной и чтобы максимальная площадь поверхности визуализировалась в фокальной плоскости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор объектива может варьироваться в зависимости от используемого микроскопа и предпочтений пользователя. Выбор программного обеспечения зависит от микроскопа. Уровень DRG приводит к более четким изображениям, позволяет программному обеспечению создавать более четкие фильмы, позволяет визуализировать больше нейронов и делает анализ более простым и точным.
  3. Подайте 1%-1,5% изофлурана в поток кислорода к носовому конусу, чтобы мышь оставалась под наркозом. Внимательно следите за животным на протяжении всей процедуры, чтобы поддерживать изофлурановую анестезию без передозировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество изофлурана, необходимое для поддержания анестезии, может варьироваться в зависимости от конкретного животного и стимула. Обычно достаточно 1,5%. Если животное двигается во время раздражителя, изофлуран следует увеличить. Если дыхание становится поверхностным, изофлуран следует уменьшить. Перед каждым раздражителем проверяйте рефлекс отвода задних конечностей на контралатеральной задней лапе.
    ВНИМАНИЕ: Изофлуран может быть вредным или вызывать головокружение или сонливость при вдыхании. Избегайте ингаляций и используйте только в хорошо проветриваемом помещении.
  4. Загрузите протокол быстрого сканирования микроскопа.
    1. Используйте типичные настройки для быстрого сканирования: размер вокселя 2,496 мкм x 2,496 мкм x 16 мкм, 512 x 512 пикселей, 10 оптических срезов Z-стек, 1 воздушная единица (AU)/32 мкм, 1% мощность лазера 488 нм 5 мВт, время пикселя 1,52 мкс, время линии 0,91 мс, время кадра 465 мс, скорость сканирования LSM 8, двунаправленное сканирование, Коэффициент усиления детектора GaAsP-PMT 650 В, цифровой коэффициент усиления 1. Оптимальные настройки могут варьироваться в зависимости от микроскопа и животного.
    2. Чтобы настроить протокол быстрого сканирования, перейдите на вкладку «Приобретение ». В разделе « Параметры сбора» перейдите на вкладку «Кадры ». Нажмите « Пресеты» > 512 x 512, чтобы настроить микроскоп на запись изображения размером 512 x 512 пикселей. Это, в свою очередь, установит значения X и Y размера вокселя на основе размера изображения, который определяется программным обеспечением микроскопа.
    3. В разделе « Параметры приобретения» перейдите на вкладку «Каналы ». Нажмите на поле Track2 . В раскрывающемся меню рядом с полем Track2 выберите Зеленый (FITC). Новая вкладка откроется под Track2.
    4. Рядом с лазерами нажмите на поле 488 . Это установит длины волн возбуждения и излучения.
    5. Рядом с ползунком 488 нм установите мощность лазера на 1%. Нажмите на кнопку 1 AU, чтобы установить апературу для 1 единицы Airy. В разделе FTC установите для параметра Master Gain значение 650 В, для параметра Digital Offset (Цифровое смещение) — значение 0, а для параметра Digital Gain (Цифровое усиление) — значение 1.
    6. На вкладке « Приобретение » установите флажок Z-Stack . Нажмите кнопку « В прямом эфире », чтобы просмотреть живое изображение ганглия. Поворачивайте ручку фокальной плоскости вверх до тех пор, пока не будет видна только небольшая дуга нейронов.
    7. В разделе « Параметры сбора» перейдите на вкладку Z-Stack > кнопку «Установить последний ». Поворачивайте ручку фокальной плоскости вниз до тех пор, пока не будет видна только небольшая дуга нейронов. В разделе « Параметры сбора» перейдите на вкладку Z-Stack > кнопку «Установить первый ». Нажмите кнопку « Жить », чтобы выключить живое изображение.
    8. В разделе « Параметры приобретения» перейдите на вкладку Z-Stack . Заполните поле «Фрагменты» числом 10. Это установит 10 оптических срезов и автоматически определит глубину вокселей.
    9. На вкладке «Приобретение» щелкните поле «Временные ряды ». В разделе «Параметры сбора» появится новая вкладка «Временные ряды». Нажмите на вкладку « Временные ряды » > поле « Циклы» с количеством циклов , которые вы хотите сделать следующими. В данном случае это 8.
    10. Установите скорость и направление сканирования. В разделе «Параметры сбора» вкладка «Режим съемки » > > « Направление » > « Двунаправленная стрелка » для сканирования по направлению съемки. Выберите вкладку «Режим съемки» > ползунок «Скорость сканирования кадра» > > 8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно можно загрузить настройки предыдущего эксперимента и отрегулировать мощность лазера только в том случае, если изображение слишком яркое или тусклое, и настроить Z-Stack Set Last и Set First.
  5. Выполните короткое 8-тактное сканирование DRG, нажав « Начать эксперимент » на вкладке « Приобретение ». Создайте фильм, сделав ортогональную проекцию сканов (по одному скану на кадр) с течением времени, и вручную проверьте четкость изображения и артефакты изображения, такие как «волны» яркости, пересекающие DRG. Отрегулируйте положение зажима и толщину оптического сечения и повторяйте этот шаг до тех пор, пока не будет получен четкий и высококачественный видеоролик.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг следует повторить, если животное движется или перемещается исследователем. Проблемы, на которые следует обратить внимание, включают области ганглия (а не только отдельные нейроны), которые, по-видимому, становятся светлее и темнее в ходе эксперимента, создавая волнистый вид или заставляя области исчезать или становиться ярче. Движение, превышающее примерно половину диаметра маленького нейрона (<20 мкм), является еще одной серьезной проблемой. Волнистость часто можно исправить, сблизив первое и последнее положение Z-Stack (см. шаг 2.4.4 выше) и сузив толщину оптического среза. В ролике 1 приведен пример волнистых ганглиев до выравнивания и установки правильной толщины оптического среза. Фильм 2 после коррекции выравнивания и толщины оптического среза. Разница незначительна, но она оказывает огромное влияние на анализ.
  6. Загрузите протокол сканирования микроскопа с высоким разрешением.
    1. Используйте типичные настройки для сканирования с высоким разрешением: размер вокселя 1,248 мкм x 1,248 мкм x 14 мкм, 1024 x 1024 пикселей, 6 оптических срезов Z-стека, 1,2 воздушной единицы (AU)/39 мкм, 5% мощность лазера 488 нм/25 мВт, время пикселя 2,06 мкс, время линии 4,95 мс, время кадра 5,06 с, скорость сканирования LSM 6, двунаправленное сканирование, Коэффициент усиления детектора GaAsP-PMT 650 В, цифровой коэффициент усиления 1. Оптимальные настройки могут варьироваться в зависимости от микроскопа и животного.
    2. Чтобы настроить протокол сканирования с высоким разрешением, перейдите на вкладку «Сбор». В разделе « Параметры сбора» перейдите на вкладку «Кадры ». Нажмите на Presets > 1024 x 1024, чтобы настроить микроскоп на запись изображения размером 1024 x 1024 пикселя. Это, в свою очередь, установит значения X и Y размера вокселя на основе размера изображения, который определяется программным обеспечением микроскопа.
    3. В разделе « Параметры приобретения» перейдите на вкладку «Каналы ». Нажмите на поле Track2 . В раскрывающемся меню рядом с полем Track2 выберите Зеленый (FITC). Новая вкладка откроется под Track2.
    4. Рядом с лазерами нажмите на поле 488 . Это установит длины волн возбуждения и излучения. Нажмите на поле «Лазерный диапазон высокой интенсивности ».
    5. Рядом с ползунком 488 нм установите мощность лазера на 5%. Нажмите на кнопку 1 AU , чтобы установить апературу для 1 единицы Airy. В соответствии с FITC установите Master Gain на 650 В, цифровое смещение на 0 и цифровое усиление на 1.
    6. На вкладке « Приобретение » установите флажок Z-Stack . Нажмите кнопку « В прямом эфире », чтобы просмотреть живое изображение ганглия. Поворачивайте ручку фокальной плоскости вверх до тех пор, пока не будет видна только небольшая дуга нейронов.
    7. В разделе « Параметры приобретения» перейдите на вкладку Z-Stack > кнопку «Установить последний ». Поворачивайте ручку фокальной плоскости вниз до тех пор, пока не будет видна только небольшая дуга нейронов. В разделе « Параметры сбора» перейдите на вкладку Z-Stack > кнопку «Установить первый ». Нажмите кнопку « Жить », чтобы выключить живое изображение.
    8. В разделе « Параметры приобретения» перейдите на вкладку Z-Stack . Заполните поле «Фрагменты» числом 6. Это установит 6 оптических срезов и автоматически определит глубину вокселей.
    9. На вкладке «Приобретение» убедитесь, что флажок «Временные ряды» снят (без временных рядов).
    10. Установите скорость и направление сканирования. В разделе «Параметры сбора» перейдите на вкладку «Режим съемки» > «Предустановки > кадра» > 1024 x 1024. Выберите вкладку «Режим съемки» > «>Направление кадра» > «Двунаправленная стрелка» для двунаправленного сканирования. Выберите вкладку «Режим съемки» > ползунок «Скорость кадра > сканирования» > 6.
    11. Если клетки помечены td-Tomato, установите микроскоп на сканирование красного канала возбуждения 592 нм/излучения 614 нм, длины волны обнаружения 600-700 нм в дополнение к зеленому каналу. Установите это, перейдя в «Параметры приобретения » и щелкнув вкладку «Каналы » > поле Track1 . В раскрывающемся меню рядом с полем Track1 выберите Red (Texas Red ). Выполните тот же процесс, что и на шаге 2.6.3, за исключением того, что щелкните поле 561 вместо поля 488 . Установите мощность лазера на 1%. Td-Tomato намного ярче, чем GCaMP3, и требует меньшей мощности лазера.
  7. Сделайте изображение DRG с высоким разрешением, нажав кнопку « Начать эксперимент » на вкладке « Приобретение ».
  8. Загрузите протокол быстрого сканирования микроскопа (см. шаг 2.4). Записывайте спонтанную активность в ДРГ в течение 80 циклов (примерно 10 мин). Создайте фильм с ортогональной проекцией и убедитесь, что изображение имеет достаточное качество для анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соображения качества такие же, как и в шаге 2.5.
  9. Для применения стимулов установите микроскоп на выполнение 15-20 сканирований. Дождитесь завершения сканирования 1–5, чтобы получить базовый уровень. Применяйте стимул во время сканирования 6-10. Подождите не менее 5 минут после каждого стимула, прежде чем применять следующий стимул, чтобы предотвратить десенсибилизацию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала следует применять механические раздражители, а затем холодные, тепловые и химические раздражители. Более слабые стимулы (например, низкая механическая сила, температуры, близкие к комнатной) должны применяться до более сильных стимулов (например, более высокая механическая сила, температуры, более далекие от комнатной температуры). При применении раздражителей следите за тем, чтобы не вызвать никакого движения ДРГ. В частности, для сильных тепловых раздражителей часто необходимо применять 2% изофлуран в течение 1-2 мин перед началом стимула. На микроскопе, используемом в этом исследовании, каждое сканирование можно четко услышать, так что исследователь может легко определить конец сканирования, что позволяет применять стимул сразу после сканирования 5. Тем не менее, любой метод, который облегчает применение стимулов в согласованный момент времени, будет работать.
  10. Для механического нажатия удерживайте щипки альгометра лапой между веслами, не касаясь лапы, и защипывайте, начиная сразу после окончания сканирования 5 и прекращая сразу после сканирования 10. Контролируйте усилие прессования с помощью альгометра (см. Таблицу материалов). Держите силу пресса как можно ближе к желаемой силе (здесь мы используем стимул для прессования 100 г) и убедитесь, что она не превышает желаемую силу на 10 г.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно обнаружить стимулы всего лишь с 0,07 г нитей фон Фрея и силой нажатия до 600 г.
  11. Для холодных и тепловых раздражителей охладите или нагрейте стакан с водой до чуть ниже (для холода) или выше (для тепловой) желаемой температуры и начните сканирование. Здесь используйте стимул 45 ° C. Когда вода будет правильной температуры, примените стимул сразу после сканирования 5, погрузив лапу в воду. Оттяните стакан сразу после сканирования 10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура должна быть в пределах 1 °C от желаемой температуры при сканировании 5. Если температура стакана неправильная, не применяйте стимул, потому что это может снизить чувствительность нейронов. Вместо этого охладите или разогрейте воду и повторите попытку. Мы измерили температуру от 0 °C (ледяная вода) до 95 °C. Однако помните, что температура выше 50 ° C может повредить ткани и сбить с толку последующие эксперименты. Точно так же некоторые химические вещества (например, тетродотоксин, капсаицин) необратимы или не могут быть вымыты и могут предотвратить дальнейшие эксперименты на животном.
  12. После того, как все стимулы были применены и зарегистрированы, усыпьте животное путем передозировки кетамином/ксилазином (200 мг/кг кетамина, 30 мг/кг ксилазина или 5 мкл на грамм массы тела раствора, приготовленного на этапе 1.1) с последующим обезглавливанием.

3. Анализ данных

  1. Откройте файлы изображений, перетащив их в ImageJ. После открытия файла выберите тип изображения в разделе «Тип изображения» > > цвет RGB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плагин StackReg21 в разделе «Плагины» > StackReg полезен для исправления и выравнивания артефактов движения. ImageJ может читать файлы большинства форматов программного обеспечения микроскопа. Выбор типа изображения зависит от предпочтений пользователя. RGB упрощает создание цветных изображений для публикации. Пакеты программного обеспечения от производителя микроскопа или cytoNet22 также могут помочь в анализе. Скачивать, устанавливать и использовать StackReg не обязательно, но рекомендуется.
  2. Используйте инструмент «Область интереса» (ROI), чтобы выбрать активные нейроны в разделе « Инструмент анализа >» > «Диспетчер рентабельности инвестиций». Нарисуйте ROI с помощью инструментов эллипса или прямоугольника на панели инструментов и поместите их в файл ROI, нажав кнопку «Добавить» в разделе « Добавить » в окне диспетчера ROI или нажав клавишу «t».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте часто сохранять файл ROI. Пользователи всегда могут восстановить ROI, перетащив файл ROI в ImageJ и щелкнув поле « Показать все » в нижней части окна ROI Manager. Сохранение в виде наложения не рекомендуется. По опыту, сохранение в виде файла ROI.zip упрощает анализ.
  3. В разделе «Анализировать > устанавливать измерения» убедитесь, что установлен флажок «Среднее значение серого »; снимите все остальные флажки в разделе «Установить измерения». Используйте инструмент с несколькими мерами в меню менеджера ROI, чтобы рассчитать интенсивность в пределах ROI. Измерьте интенсивность с помощью окна ROI в разделе « Еще» > «Мультимера».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда соседние нейроны будут находиться слишком близко друг к другу, чтобы нарисовать отдельные ROI. Эти нейроны не могут быть использованы для измерения транзиторной интенсивности, но могут быть включены в подсчет активирующих нейронов.
  4. Сохраните CSV-файл, созданный Multimeasure, и откройте CSV-файл с помощью любого программного обеспечения для работы с электронными таблицами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В Дополнительном файле 1 приведен пример шаблона электронной таблицы, который поможет в анализе.
  5. Рассчитайте интенсивность переходного процесса Ca 2+ как ΔF / F 0 = (F t- F 0) / F 0, где Ft — интенсивность пикселей в ROI в интересующей момент времени, а F 0 — базовая интенсивность, определяемая путем усреднения интенсивности либо 2-4 кадров до переходного процесса Ca 2+ для спонтанной активности, либо первых 1-5 кадров ROI для Ca 2+ переходные процессы, возникающие во время стимуляции. Исключите любые нейроны, продуцирующие пики Ca2+ до стимула, и не анализируйте активность после окончания стимула.
  6. Для анализа переходной интенсивности Ca2+ случайным образом отберите примерно равное количество нейронов из каждого ганглия, чтобы избежать искажения данных в сторону ганглиев, которые произвели наибольшее количество реагирующих нейронов. Исключите пики, где ΔF / F 0 < 0,15.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют альтернативные опубликованные методы анализа и включения/исключения нейронов 11,12,23,24,25,26,27,28.
  7. Измерьте диаметр нейронов с помощью инструмента «Линия » на панели инструментов в ImageJ. Рассчитайте средний диаметр по линиям, проведенным по самому длинному и самому короткому диаметрам.

Результаты

figure-results-68
Рисунок 4: Репрезентативные изображения ганглиев дорсальных корешков L5 мышей Pirt-GCaMP3. (A, D) Показано однокадровое сканирование с высоким разрешением ганглиев дорсальных корешков L5 мышей Pir...

Обсуждение

Постоянная боль присутствует при широком спектре расстройств, изнуряя и/или снижая качество жизни примерно у 8% людей29. Первичные сенсорные нейроны обнаруживают вредные раздражители на коже, а их пластичность способствует постоянной боли8. В то время как нейро...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения R01DE026677 и R01DE031477 (для Y.S.K.), стартап-фондом UTHSCSA (Y.S.K.) и премией «Восходящая звезда» от системы Техасского университета (Y.S.K.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anased Injection (Xylazine)Covetrus, Akorn33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DICCal Zeiss422642-9900-000
Cotton Tipped ApplicatorsMcKesson24-106-1S
Curved HemostatFine Science Tools13007-12
DC Temperature ControllerFHC40-90-8D
DC Temperature Controller Heating PadFHC40-90-2-05
Dumont Ceramic Coated ForcepsFine Science Tools11252-50
FHC DC Temperature ControllerFHC40-90-8D
Fluriso (Isoflurane)MWI Animal Health, Piramal Group501017
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16221-14
GelFoamPfizer09-0353-01
Ketaset (Ketamine)ZoetisKET-00002R2
Luminescent Green Stage TapeJSITON/ AmazonB803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 Isoflurane VaporizerMidmark91305430
Micro dissecting scissorsRobozRS-5882
Micro dissecting spring scissorsFine Science Tools15023-10
Micro dissecting spring scissorsRobozRS-5677
Mini Rectal Thermistor ProbeFHC40-90-5D-02
Operating scissorsRobozRS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J miceJohns Hopkins UniversityN/AEither sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.
SMALGO small animal algometerBioseb In vivo Research InstrumentsBIO-SMALGO
Stereotaxic frameKopf Model 923-B923-B
td-Tomato C57BL/6J miceJackson Laboratory7909
Top Plate, 6 in x 10 inNewport290-TP
TrpV1-Cre C57BL/6J miceJackson Laboratory17769
Zeiss LSM 800 confocal microscopeCal ZeissLSM800
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition SoftwareCal ZeissZen (Blue Edition) 2.6

Ссылки

  1. Rivero-Melián, C., Grant, G. Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate. The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).
  2. Wessels, W. J., Marani, E. A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats. Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).
  3. Schmalbruch, H. The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat. The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).
  4. Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice. The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).
  5. Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).
  6. Liu, Y., Ma, Q. Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).
  7. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
  8. Stucky, C. L., Mikesell, A. R. Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves. Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).
  10. Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).
  11. Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
  12. Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).
  13. Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).
  14. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  15. MacDonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
  16. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  17. Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
  18. Kim, A. Y., et al. a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1. Cell. 133 (3), 475-485 (2008).
  19. Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
  20. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  21. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  22. Mahadevan, A. S., et al. cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).
  23. Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  24. Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).
  25. Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
  26. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
  27. Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).
  28. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  29. Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).
  30. Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).
  31. Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).
  32. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
  33. Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).
  34. Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons. The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).
  35. Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. Regulators of G-protein signaling in receptor complexes. Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).
  36. Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).
  37. Tan, C. H., McNaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
  38. Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
  39. Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
  40. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  41. Harada, K., et al. Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging. Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены