Выделение внеклеточных везикул с низким содержанием эндотоксинов, полученных из линий раковых клеток

Резюме

Предлагаемый протокол включает в себя рекомендации о том, как избежать контаминации эндотоксином при выделении внеклеточных везикул из надосадочных продуктов клеточных культур и как правильно их оценивать.

Аннотация

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой гетерогенную популяцию мембранных везикул, высвобождаемых клетками in vitro и in vivo. Их вездесущность и значительная роль в качестве носителей биологической информации делают их интригующими объектами исследования, требующими надежных и повторяющихся протоколов для их выделения. Однако реализовать весь их потенциал сложно, поскольку все еще существует множество технических препятствий, связанных с их исследованиями (например, правильное приобретение). В данном исследовании представлен протокол выделения малых ЭВ (по номенклатуре MISEV 2018) из супернатанта культуры линий опухолевых клеток на основе дифференциального центрифугирования. Протокол включает в себя рекомендации о том, как избежать загрязнения эндотоксинами во время выделения электромобилей и как правильно их оценивать. Загрязнение электромобилей эндотоксинами может значительно затруднить последующие эксперименты или даже замаскировать их истинные биологические эффекты. С другой стороны, упущенное из виду присутствие эндотоксинов может привести к неправильным выводам. Это имеет особое значение, когда речь идет о клетках иммунной системы, включая моноциты, потому что моноциты составляют популяцию, которая особенно чувствительна к остаткам эндотоксина. Поэтому настоятельно рекомендуется проводить скрининг EV на загрязнение эндотоксинами, особенно при работе с чувствительными к эндотоксину клетками, такими как моноциты, макрофаги, клетки-супрессоры миелоидного происхождения или дендритные клетки.

Введение

Внеклеточные везикулы (ВВ), согласно номенклатуре MISEV 2018, являются собирательным термином, описывающим различные подтипы секретируемых клетками мембранных везикул, которые играют решающую роль в многочисленных физиологических и патологических процессах ^1,2. Кроме того, электромобили обещают стать новыми биомаркерами различных заболеваний, а также терапевтическими агентами и средствами доставки лекарств. Однако реализовать весь их потенциал сложно, так как все еще существует множество технических препятствий, связанных с их приобретением³. Одной из таких проблем является выделение эл....

протокол

1. Подготовка ультрацентрифужных пробирок

1. Используйте стерильные одноразовые пробирки. Если это невозможно, повторно используйте ультрацентрифужные пробирки после их мытья моющим средством с помощью стерильной пастеровской пипетки или других одноразовых аппликаторов. Помните, что ультрацентрифужные пробирки должны быть предназначены для одного типа центрифугируемого материала (надосадочная жидкость / сыворотка / плазма клеточной культуры) и вида (человек / мышь / и т. Д.).
2. После стирки моющим средством промойте пробирки ультрацентрифуги деионизированной водой, не содержащей LPS, 3 раза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте некачественную ....

Результаты

Предпосылкой или обязательным этапом этого протокола является исключение возможного загрязнения эндотоксинами из реагентов. Все используемые реагенты, такие как FBS, DMEM, RPMI, PBS и даже ультрацентрифужные пробирки, должны не содержать эндотоксинов (<0,005 ЕС / мл). Поддерживать режим отсутств.......

Обсуждение

В последние несколько лет все большее значение приобретают методы надлежащей изоляции электромобилей, позволяющие проводить их дальнейший надежный анализ, например, в контексте получения надежных омиксных и функциональных данных²⁴. Основываясь на предыдущем опыте иссле?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alix (3A9) Mouse mAb	Cell Signaling Technology	2171
1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic	GoogLab Scientific	GBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Flow Cytometr	BD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II	BD Biosciences	551809
CD9 (D8O1A) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13174
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad Laboratories, Inc.	17001401
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)	Corning	10-013-CV
ELX800NB, Universal Microplate Reader	BIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044
Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin	Biowest	S1860-500
Gentamicin, 50 mg/mL	PAN – Biotech	P06-13100
Goat anti-Mouse IgG- HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Goat anti-Rabbit IgG- HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005
Immun-Blot PVDF Membrane	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1620177
LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)	Enzo Life Sciences, Inc.	ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1703930
Nanoparticle Tracking Analysis	Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)	Invitrogen	NP0004
Parafilm	Sigma Aldrich	P7793	transparent film
Perfect 100-1000 bp DNA Ladder	EURx	E3141-01
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit	Thermo Scientific	A39552
PP Oak Ridge Tube with sealing caps	Thermo Scientific	3929, 03613
RPMI 1640	RPMI-1640 (Gibco)	11875093
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystem	A24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor	Thermo Scientific	75000100
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1704401
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34577
SW480 cell line	American Type Culture Collection(ATCC)
SW480 cell line	American Type Culture Collection (ATCC)
Syringe filter 0.22 um	TPP	99722
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1703940	Transfer machine
Transfer pipette, 3.5 mL	SARSTEDT	86.1171.001