Мышиная модель ассоциативного пересечения печени и лигирования воротной вены для процедуры этапной гепатэктомии с помощью микроскопии

Резюме

Было показано, что ассоциирование перевязки печени и перевязки воротной вены для этапной гепатэктомии (ALPPS) приводит к заметной регенерации печени через несколько недель после операции первого этапа. Животные модели, которым была проведена ALPPS, были разработаны для изучения потенциальной способности печени к регенерации и достижения благоприятных клинических результатов.

Аннотация

Гепатэктомия широко рассматривается как основной метод лечения злокачественных новообразований печени; Тем не менее, послеоперационная печеночная недостаточность остается основной причиной периоперационной смертности, серьезно влияя на исходы лечения пациентов. В здоровой печеночной среде будущий остаток печени (FLR) должен превышать 25%, а в случаях цирроза это требование увеличивается до более чем 40%. Недостаточность FLR в настоящее время является основным препятствием в прогрессировании хирургии печени.

Традиционные методы усиления гипертрофии FLR в основном сосредоточены на эмболизации воротной вены (ПВЕ), но ее эффективность значительно ограничена. В последние годы появились многочисленные сообщения о новом методе двухфазной гепатэктомии, включающем разделение печени и перевязку воротной вены, известный как ассоциативное разделение печени и лигирование воротной вены для этапной гепатэктомии (ALPPS). ALPPS превосходит ПВЕ по эффективной и значительной индуцированию гипертрофии FLR. Тем не менее, детально изученные механизмы, управляющие регенерацией печени при содействии ALPPS, до конца не изучены. Таким образом, репликация ALPPS на животных моделях имеет решающее значение для тщательного исследования молекулярных механизмов регенерации печени, предлагая ценные теоретические и практические знания.

Введение

Печень обладает огромным регенеративным потенциалом, быстро пролиферируя и восстанавливая метаболические потребности в течение всего 3 месяцев после резекции при различных заболеваниях печени¹. Тем не менее, необходимость установления полноты опухолевых краев обусловливает необходимость неизбежности обширного печеночного иссечения. Таким образом, обеспечение достаточного объема партисипативной печеночной среды, известной как будущий остаток печени (FLR), приобретает первостепенное значение². За последние несколько десятилетий ALPPS стала прорывным методом в хирургии печени, специально разработанным для пациентов с недостаточным остаточным объемом печени после резекции опухоли, что было объявлено одним из самых благоприятных прорывов в области онкохирургии печени³.

Значительный прогресс был достигнут в разработке животных моделей ALPPS. Идеальная модель обычно требует независимого притока крови (воротная вена и печеночная артерия) и оттока (печеночная вена) в сохраненной печеночной доле и четкого разделения между сохраненной и подлежащей резецации печеночных долей для предотвращения коллатерального^{кровообращения}. Хотя АЛПП стимулирует быструю регенерацию печени в оставшейся ткани печени, конкретные механизмы этого процесса до сих пор неясны.

В настоящее время модели ALPPS подразделяются на три типа: модели крупных животных (например, свиней и овец), модели среднего размера (например, кролики и грызуны) и маленькие модели (например, мыши)⁵. Использование мышей, с их быстрым размножением и легкостью генетической модификации, особенно эффективно для углубленного изучения механизмов регенерации печени⁶. Кроме того, строение печени мышей, особенно их средняя печеночная вена, очень похоже на строение печени человека, что делает их очень подходящими для разработки модели ALPPS.

Важно отметить, что большинство пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой в клинической практике имеют фоновые заболевания печени, в отличие от моделей здоровой печени, обычно используемых в исследованиях⁷. Таким образом, использование мышей с предварительно подготовленным фиброзом печени или вирусными инфекциями может более точно моделировать хирургические реакции и послеоперационную регенерацию печени, наблюдаемую у пациентов с различными заболеваниями печени⁸. Такой подход может выявить новые терапевтические мишени, имеющие клиническую значимость.

До сих пор несколько известных исследовательских групп, таких как Университет Цюриха и Токийский университет, успешно разработали модели ALPPS ^9,10 для мышей. Создание стандартизированной модели мыши в контролируемых условиях может улучшить наше понимание быстрой регенерации печени, наблюдаемой после процедур ALPPS.

протокол

Все эксперименты в этом протоколе были одобрены ветеринарными органами Народной больницы провинции Цзянси (номер 70/2022). Кроме того, все экспериментальные этапы были выполнены в строгом соответствии с требованиями Комитета по уходу и использованию институциональных животных.

1. Начало операции

Самцы мышей C57BL/6 весом 20-22 г содержались в хорошо проветриваемой клетке, содержащейся в стандартной среде, свободной от патогенов, с циклом свет/темнота 12 ч/12 ч. Животным был предоставлен свободный доступ к пище и воде при контролируемой температуре окружающей среды 22 ± 1 °C. Операция проводилась в специализированном микрохирургическом кабинете с использованием хирургического микроскопа (рис. 1). Мышей в фиктивной группе оперировали только лапаротомией, но операция на печени не проводилась. В группе ПВЛ была перевязана часть ветвей воротной вены, а в группе АЛППС средняя доля печени была пересечена на основе лигирования воротной вены (ПВЛ).

1. Подвергните мышей 4-6-часовому предоперационному периоду голодания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Голодание необходимо, потому что прием пищи вызывает выпячивание желудка у мышей, это приводит к плохому операционному полю и подвержено случайному повреждению стенки желудка.
2. Расположите стерильные хирургические инструменты, в том числе микрощипцы, ножницы, абдоминальные ретракторы, а также заранее подготовленные 8-0 Лигатурные нити для воротной вены, на приставном столике. Замочите интраоперационные материалы, состоящие из стерильной марли и ватных шариков, в физиологическом растворе при температуре 37 °C.
3. Для индукции животным подвергают воздействию 5% v/v изофлурана в течение 30 с с последующей поддерживающей анестезией с использованием 3 об.% изофлурана до достижения глубокого обезболивающего состояния. Исследуйте рефлекс защемления пальца ноги, чтобы выяснить уровень анестезии. Подкожно вводят медетомидин в дозе 5 мг/кг во время фазы индукции.
4. Нанесите мазь на глаза животных и введите подкожно 1 мл раствора лактата Рингера, смешанного с 5% глюкозой, разделив дозу поровну между нижней частью живота с каждой стороны.
5. Тщательно выбрейте брюшную область с помощью небольших машинок для стрижки шерсти животных, охватывающей боковую область шириной 2 см от мечевидного отростка до области гениталий.
6. Тщательно продезинфицируйте место операции 3 раза, чередуя раунды повидон-йода и спирта.
7. Сделайте разрез по средней линии длиной 2,5-3,0 см на коже с помощью хирургического скальпеля, затем с помощью хирургических ножниц деликатно вскройте брюшную полость.
8. Используйте брюшной ретрактор для расширения разреза, способствуя мягкому вытяжению двенадцатиперстной кишки и сегмента тонкой кишки с помощью стерильных влажных ватных тампонов. Накройте эти структуры заранее подготовленной стерильной марлей, одновременно обнажая печеночный сегмент воротной вены.

2. Перевязка воротной вены (ПВЛ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все действия были мягкими на протяжении всей процедуры. Используйте смоченные ватные тампоны при манипуляциях с тканями печени.

1. Отшелушите брюшину и кишечный тракт и убедитесь, что воротная вена полностью обнажена.
2. Обнажая главную портальную вену, продолжайте огибать ее ветви, используя медленные, преднамеренные движения вперед, толкающие и расширяющиеся.
3. Последовательно определите различные ветви воротной вены в следующем порядке: (1) правая задняя ветвь, (2) объединенная левая боковая и левая срединная ветви и (3) хвостатая ветвь (рис. 2А).

3. Диссекция правой задней ветви воротной вены

1. Пройдя по воротам печени через главную воротную вену, обратите внимание на заметную ветвь правой задней доли, которая стала видимой.
2. Используйте смоченные ватные тампоны в качестве наполнителя и отделите среднюю долю печени и правую заднюю долю, чтобы избежать потенциальной травмы.
3. Обязательно рассеките вдоль капсулы Глиссона (брюшину, которая простирается над поверхностью печени) и натяните шелк длиной 1,5 см, чтобы обвязать вокруг воротной жилки ветви.
4. Перевязать правую заднюю ветвь воротной вены 8-0 шелковый шовный материал. Надежным показателем успешной перевязки воротной вены является видимая бледность печени.

4. Диссекция левой боковой и левой медиальной ветвей воротной вены

1. Левая латеральная доля (LLL) и левая медиальная доля (love my life) имеют общую главную воротную вену. Обязательно рассмотрите любую потенциальную щель между LLL и хвостатой долей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лигирование LLL и ветвей воротной вены «Люби мою жизнь» является самым сложным в этой хирургической модели, потому что микрощипцы должны проходить через пространство вокруг воротной вены и избегать повреждения печени.
2. Введите микрощипцы через вход в шаге 4.1 и двигайте рукой медленно, так как даже малейшее сопротивление намекает на потенциальную близость к печени или кровеносным сосудам.
3. Когда вы почувствуете сопротивление, слегка отрегулируйте микрощипцы так, чтобы они двигались вперед и через поверхность капсулы Глиссона правой медиальной доли (РМЛ) (рис. 3C).
4. Используйте подготовленный 8-0 шелковый шов завязать вокруг воротной вены LLL и любить свою жизнь ветки. Ищите поразительную ишемическую демаркацию в средней доле печени, в то время как левая доля становится бледной после перевязки ветвей воротной вены.

5. Рассечение хвостатой ветви воротной вены

1. Рассеките хвостатую долю и с помощью ватной палочки заполните потенциальное пространство между главной воротной веной и хвостатой долей.
2. Снимите кожуру брюшины хвостатых долей, чтобы визуализировать воротную жилку ветвей мочки.
3. Используйте шовный материал, а не завязывание, чтобы перевязать хвостатую ветвь, следя за тем, чтобы траектория иглы адекватно оборачивала хвостатую ветвь воротной вены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сложность перевязки хвостатой ветви воротной вены заключается в том, что воротная вена хвостатой доли инкапсулирует ткань печени и находится близко к основной воротной вене. Рекомендуется глубина проникновения иглы 1 мм.

6. Пересечение печени и холецистэктомия

1. Обратите внимание на четкую демаркационную линию в средней доле печени и выполните пересечение вдоль этой линии (Рисунок 2B).
2. С помощью пера для электрокоагуляции создайте линию предварительного среза 0,5 мм вдоль линии разграничения.
3. С помощью микрощипцов и электрокаутерной ручки разрежьте ткань печени, применяя ватные палочки для остановки кровотечения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сложность при пересечении заключается в том, чтобы освоить глубину. Цель состоит в том, чтобы расщепить печень как можно ближе к полой вене. Интраоперационного кровотечения трудно избежать, и оно требует повторяющейся практики для освоения глубины пересечения. Для усиления гемостаза можно использовать горячее обжигание, ватные палочки и желатиновые губки.
4. Удалите желчный пузырь в последнюю очередь, так как это обеспечит хорошую точку втягивания в течение всей операции.
5. Используйте ватный тампон для контролируемого давления для гемостаза, и если кровотечение продолжается, нижняя полая вена повреждается, и эффект от наложения швов будет плохим; Усыпите животное без раздумий.

7. Заключительные этапы операции

1. Обеспечьте тщательное размещение тонкой кишки в брюшной полости перед закрытием.
2. Надежно закройте брюшину и брюшную стенку с помощью рассасывающихся швов 6-0, а кожу - с помощью рассасывающихся швов 4-0.
3. Еще раз продезинфицируйте поверхность кожи, чтобы обеспечить оптимальную чистоту.
4. Подкожно введите 1 мл физиологического раствора и фентанила 0,02 мг/кг плюс мелоксикам 4 мг/кг в место разреза для облегчения послеоперационной боли и устранения любой дополнительной интраоперационной потери жидкости.
5. Поместите животное на утепленную поверхность, чтобы облегчить естественное пробуждение, и следите за кровоснабжением их конечностей. Затем поместите их по отдельности в клетки для продолжения наблюдения, когда они придут в сознание.
6. Подкожно ввести медетомидин в дозе 4 мг/кг после выздоровления, продолжая в течение 24 ч после операции.

8. Интраоперационное измерение регенерации и функции печени

1. Усыпьте мышей и соберите образцы печени и крови с интервалом в 1, 2, 3 и 7 дней после операции.
2. Выполнить окрашивание ПЭ и исследование функции печени и исследовать маркеры воспаления в сыворотке крови, тем самым обеспечив дополнительную валидацию влияния конструкции модели.
3. Задокументируйте ежедневные изменения массы тела и соотношения FLR/BW (массы тела) у мышей в течение 1 недели после хирургической процедуры.

Результаты

В отличие от ПВЛ (этапы 2,3,4 и 5 протокола), мыши, подвергшиеся хирургическому вмешательству ALPPS (шаги 2,3,4,5 и 6), продемонстрировали повышенную склонность к клеточной пролиферации. На рисунке 2 показана ишемическая демаркация средней доли печени после пере...

Обсуждение

В этом исследовании представлен протокол начальной фазы операции ALPPS у мышей, включающей частичное перевязку воротной вены и разделение срединной доли печени. Этот метод очень похож на процедуру ALPPS человека, при этом уникальная дольчатая структура печени мыши и двой...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% glucose injection (500 mL)	Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)	H20003666	Efficient, cheap,Easy to access
anaesthesia machine	RWD (www.rwdls.com)	R500	low price and valuable quality. It is suitable for operations with beginners
C57 BL/6	The Jackson Lab	22349-2023	Stability of strains
isoflurane	KCSW (kcsw.szqisoubao.com)	H19980141	durable, cost-effective
meloxicam	Boehringer-Ingelheim	H20020217	Durable and efficient
microforceps	maydeal	60018920	Durable and efficient
microinstrument	CH microsurgical instrument factory	HC-A804-1	durable, cost-effective
sodium lactate ringer	Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)	H20193277	Efficient, cheap, easy to access
suture line	CH microsurgical instrument factory	6-0/8-0	high performance-price ratio
topical antibodies	chenxin pharmacology (www.cisen-pharma.com)	H20020217	Effectively avoid incision infection