Разработка системы протопластов капусты для изучения толерантности к гипоксии у капусты

Резюме

Этот протокол описывает эффективную систему протопластов мезофилла капусты. Были протестированы различные методы лечения с недостатком кислорода, и система показала высокую активацию генов, реагирующих на гипоксию, что способствовало изучению генетических и молекулярных механизмов толерантности к затоплению у овощей сорта Brassicaceae .

Аннотация

Поскольку изменение климата приводит к увеличению количества обильных дождей, капуста, ключевой овощ семейства Brassicaceae , сталкивается со значительными потерями урожая из-за стресса, вызванного наводнениями. Для выявления механизмов толерантности к затоплению у кочанов необходима универсальная платформа для генетических функциональных исследований, позволяющих преодолеть трансформационно-неподатливый характер кочанов. В данном исследовании была разработана система экспрессии переходных процессов капустных протопластов и соответствующий протокол индукции гипоксии протопластов. Этот протокол позволил добиться высокой урожайности и целостности выделения протопластов из капустных листьев, при этом эффективность трансфекции превысила 40% при использовании оптимизированных ферментативных условий. Чтобы смягчить потенциальное гипоксическое воздействие перед лечением, раствор W5 пузырчат с газообразным кислородом для повышения уровня растворенного кислорода. Было протестировано несколько химических веществ для регулировки уровня кислорода и физиологического поглощения кислорода, включая EC-Oxyraze, OxyFluor, сульфит натрия и упаковку для поглощения кислорода. Анализ на двойную люциферазу показал, что промоторы генов анаэробной реакции дыхания BoADH1 и BoSUS1L активировались в протопластах капусты после лечения гипоксией, при этом самый высокий уровень индукции наблюдался после лечения пакетом поглотителей кислорода. Таким образом, система экспрессии протопластов капусты в сочетании с лечением гипоксии демонстрирует эффективную и удобную платформу. Эта платформа может облегчить изучение функции генов и молекулярных механизмов, связанных с реакцией на гипоксию у капусты.

Введение

Глобальное изменение климата усугубило проблему наводнений, которая становится все более критической проблемой во всем мире. В последние десятилетия наблюдается тенденция к увеличению частоты наводнений, что приводит к значительным потерям урожая ^1,2. Капуста (Brassica oleracea var. capitata L.), овощ значительного мирового значения, подвержена неблагоприятному воздействию обильных дождей, что обуславливает необходимость разработки устойчивых к наводнениям сортов капусты для обеспечения устойчивого производства в условиях экстремальных погодных явлений. Таким....

протокол

В исследовании использовались два сорта товарной капусты (B. oleracea var. capitata): 'Fuyudori' и '228'. Графическое представление рабочего процесса протокола показано на рисунке 1. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка рассады капусты

1. Сеять семена капусты 'Фуюдори' и '228' с использованием коммерческого растительного субстрата в круглые квадратные отверстия (Г 4,5 см x В 4,5 см) 48-луночных противней (Д 49 см x Ш 28 см x ....

Результаты

В этой работе была успешно разработана система переходной экспрессии с использованием протопластов капусты (см. Рисунок 1 для рабочего процесса). Протопласты выделяли из 2-3-недельных настоящих листьев капусты соответствующего размера (рис........

Обсуждение

Этот протокол представляет собой оптимизированный метод выделения протопластов из двух коммерческих сортов капусты. Эффективность этого метода в первую очередь оценивается по двум важнейшим параметрам контроля качества: выходу жизнеспособных протопластов и эффек.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)	PhytoTech Labs	M825	For enzyme solution preparation
228 cabbage seeds	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Conical Tube	SPL Life Sciences	50050	For enzyme solution preparation
6-well tissue culture plate	Alpha Plus	16106	For protoplast incubation
70 μm cell strainer	Sorfa	SCS701	For protoplast filtration
9-cm Petri dish	Alpha Plus	16001	For enzymatic digestion
Anaerobic jar	HIMEDIA	Anaerobic Jar 3.5 L	For hypoxia treatment
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	For W5 solution preparation and culture plate coating
Calcium chloride	J.T.Baker	131301	For W5 solution and PEG solution preparation
Cellulase R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Desiccator	Tarsons	402030	For vacuum infiltration
D-Glucose	Bioshop	GLU501	For W5 solution preparation
Dissolved oxygen meter	Thermo Scientific	Orion Star A223	For oxygen measurement
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	For enzyme solution, PEG solution, and MMG solution preparation
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	For Dual-luciferase reporter assay
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	For hypoxia treatment
Fuyudori cabbage seeds	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR21GIII	For protoplast harvest
Macerozyme R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Magnesium chloride	Alfa Aesar	12315	For MMG solution preparation
Microcentrifuge	Hitachi	CT15RE	For protoplast harvest
Microplate	Greiner	655075	For Dual-luciferase reporter assay
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax Mini	For Dual-luciferase reporter assay
Millex 0.22 μm syringe filter	Merck	SLGP033RS	For enzyme solution preparation
Oil Free Vacuum Pump	Rocker	Rocker 300	For vacuum infiltration
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	For hypoxia treatment
Oxygen absorber pack	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	For hypoxia treatment
Oxygen concentrator	UTMOST PERFECT	AII-X	For oxygen-bubbling in W5 solution
Plant substrate	Klasmann-Deilmann	Potgrond H substrate	For cabbage seedlings preparation
Plasmid Midi Kit	QIAGEN	12145	For purification of transfection-grade plasmid DNA
Polyethylene Glycol 4000	Fluka	81240	For protoplast transfection
Potassium chloride	J.T.Baker	304001	For W5 solution preparation
Razor blade	Gillette		For cabbage leaf strips preparation
Sodium chloride	Bioshop	SOD002	For W5 solution preparation
Sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505	For hypoxia treatment
Water Bath	Yihder	BU-240D	For enzyme solution preparation