В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой рукописи мы представляем комплексный протокол оценки выживаемости антибиотиков для Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, трансформируя плазмиды в P. aeruginosa и S. aureus для создания репортерных штаммов и визуализации фенотипических вариантов, таких как персистенты, с помощью покадровой эпифлуоресцентной микроскопии.

Аннотация

Персистенция антибиотиков — это явление, при котором небольшое количество бактериальных клеток в генетически восприимчивой популяции выживает после лечения антибиотиками, которые убивают другие генетически идентичные клетки. Бактериальные персистенты могут возобновить репликацию после окончания лечения антибиотиками и обычно считаются причиной неэффективности клинического лечения. Недавняя работа, использующая возможности покадровой флуоресцентной микроскопии, в которой бактерии помечаются флуоресцентными транскрипционными репортерами, трансляционными репортерами и/или красителями для различных клеточных особенностей, продвинула наше понимание персистентов Escherichia coli за пределы того, что можно было бы узнать из анализов выживаемости антибиотиков на популяционном уровне. Такие подходы на отдельных клетках, а не на объемных популяционных анализах, имеют важное значение для определения механизмов формирования персистентных клеток, реакции на повреждение и выживания. Тем не менее, методы изучения персистентов у других важных патогенных видов на этом уровне детализации остаются ограниченными.

Это исследование обеспечивает адаптивный подход к покадровой визуализации Pseudomonas aeruginosa (грамотрицательная палочка) и Staphylococcus aureus (грамположительный кокк) во время лечения антибиотиками и восстановления. Мы обсуждаем молекулярно-генетические подходы к введению флуоресцентных репортеров в эти бактерии. Используя эти репортеры, а также красители, мы можем отслеживать фенотипические изменения, морфологические особенности и судьбу отдельных клеток в ответ на лечение антибиотиками. Кроме того, мы можем наблюдать фенотипы отдельных персистентов по мере их реанимации после лечения. В целом, эта работа служит ресурсом для тех, кто заинтересован в отслеживании выживаемости и экспрессии генов отдельных клеток, обработанных антибиотиками, включая персистентные, как во время, так и после лечения, в клинически важных патогенах.

Введение

Бактериальные патогены могут уклоняться от воздействия антибиотиков с помощью двух основных механизмов: устойчивости к антибиотикам, которая включает генетические изменения, и фенотипической толерантности, которая включает в себя негенетические изменения. Устойчивость к антибиотикам – это генетически закодированное явление, которое наделяет данную бактериальную клетку способностью не только выживать, но и размножаться в присутствии антибиотика. Фенотипическая толерантность, которая может охватывать устойчивые к антибиотикам или устойчивые к антибиотикам бактерии, возникает, когда клетки выдерживают бактерицидное лечение антибиотиками без приобретения способности к репликации в присутствии ингибирующей концентрации антибиотика 1,2. Отличие толерантности от персистенции заключается в том, что толерантность относится к способности всей популяции выжить после лечения, в то время как персистенция относится к подмножеству изогенной, но фенотипически гетерогенной популяции, которая выживает после лечения антибиотиками. Когда клональная культура обрабатывается бактерицидными антибиотиками, а выжившие, которые остаются в культуре, строятся в зависимости от времени в логлинейном масштабе, при этом обычно обнаруживается двухфазная кривая при наличии персистентных антибиотиков. На этих кривых первая фаза показывает, что большая часть популяции погибает относительно быстро, а вторая фаза указывает на то, что персистирующая фракция антибиотика погибает медленнееили не убивается вовсе 1,2.

Персистентность антибиотиков представляет собой серьезную нагрузку на глобальные системы здравоохранения. Например, считается, что Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa, которые находятся в центре внимания этой статьи, вызывают антибиотикостойкие инфекции, включая рецидивирующие инфекции дыхательных путей у пациентов с муковисцидозом и хроническими раневыми инфекциями 3,4. Таким образом, дальнейшее выяснение персистентной клеточной биологии и фенотипических программ имеет решающее значение. Несмотря на прогресс, достигнутый в понимании того, как персистентные вещества формируются и реанимируются, критические пробелы в знаниях, касающихся координации метаболического перепрограммирования и молекулярных событий в отдельных клетках, лежащих в основе персистенции, остаются 5,6,7,8.

Эффективное изучение персистенции оказалось технической проблемой. Поскольку персистенция наблюдается только в небольшом подмножестве бактериальной популяции, методы, которые отбирают образцы больших бактериальных популяций, часто не позволяют получить соответствующую биологическую информацию. Кроме того, поскольку фенотипические изменения, лежащие в основе персистенции, являются преходящими и не наследуются, отслеживание судьбы персистентных клеток может быть сложным 1,8,9,10,11. Как только бактериальные персистентные бактерии возобновляют рост, они могут делиться и давать начало как персистентным, так и нестойким популяциям, что делает невозможным обогащение популяций чистых персистентов путем культивирования. Эти проблемы подчеркивают потребность в методах, которые могут удовлетворять следующим критериям: 1) способность захватывать биологическую информацию о живых одиночных клетках и 2) возможность использования в тандеме с флуоресцентными красителями, зондами, сенсорами и репортерами, которые позволяют исследовать фенотипы отдельных клеток в гетерогенных популяциях с течением времени.

Последние достижения в области технологий одиночных клеток предоставили возможность эффективно исследовать бактериальную гетерогенность и преодолеть эти препятствия в изучении персистенции12,13. Некоторые из этих методов включают флуоресцентную микроскопию, проточную цитометрию/сортировку клеток, активируемых флуоресценцией, микрофлюидику и секвенирование РНК одиночных клеток12,13. В данной работе мы описываем протоколы для выяснения физиологии персистентных одиночных клеток с помощью эпифлуоресцентной покадровой микроскопии транскрипционных или трансляционных репортерных штаммов. Флуоресцентная микроскопия является мощным методом, который удовлетворяет критериям изучения персистентных фенотипов, а именно, позволяет определить, какие отдельные клетки в большой популяции размножаются после удаления антибиотиков и, таким образом, могут быть определены как персистентные. С внедрением технологий автоматизированных камер и инкубационных камер захват живых бактериальных клеток стал широко доступен в области микробиологии. Важно отметить, что покадровая микроскопия дает возможность визуализировать отдельные клетки в режиме реального времени, в течение нескольких часов и даже дней, что позволяет отслеживать бактерии до, во время и после лечения антибиотиками. Результаты этих исследований с использованием покадровой микроскопии обладают огромным потенциалом для понимания сложных механизмов персистентной биологии.

протокол

1. Получение флуоресцентных репортерных штаммов  S. aureus путем трансформации и трансдукции

ПРИМЕЧАНИЕ: Репортерные штаммы содержат флуоресцентный белок, указывающий на экспрессию гена или белка, представляющего интерес. Транскрипционные репортеры содержат дубликат нативной промоторной последовательности для интересующего гена перед флуоресцентным белком, так что флуоресценция увеличивается по мере увеличения экспрессии интересующего гена. Трансляционные репортеры связывают открытые рамки считывания флуоресцентного белка и интересующего белка с помощью гибкого пептидного соединителя. Визуализация репортерных штаммов с помощью микроскопии живых клеток может показать, связан ли данный ген/белок, представляющий интерес, с конкретными морфологиями клеток или их судьбой (рис. 1, дополнительное видео 1 и дополнительное видео 2). Выбирайте флуоресцентный белок, оптимизированный с точки зрения кодонов для S. aureus. В то время как в этом исследовании используется sGFP из pCM29, подаренный доктором Александром Хорсвиллом, генетический инструментарий библиотеки мутантных мутантов Небраски содержит плазмиды, несущие кодон-оптимизированные sGFP, eYFP, eCFP, DsRed.T3 и eqFP65017,18.

  1. Трансформируйте репортерные плазмиды в S. aureus RN4220.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий раздел протокола был адаптирован из семинара «Основы стафилококковой генетики и метаболизма» в Медицинском центре Университета Небраски19,20.
    1. Во-первых, приготовьте электрокомпетентный S. aureus RN4220. Приготовьте 200 мл бульона B2, смешав 2 г казаминокислот, 5 г дрожжевого экстракта, 2 мл 10% K2HPO4, pH 7,5, 2 мл 50% раствора глюкозы и 5 г NaCl. Доведите объем до 100 мл стерильной ультрачистой водой. Коротко перемешайте при температуре 37 °C для растворения компонентов и простерилизуйте с помощью фильтра на крышке бутылки (размер пор 0,22 мкм).
    2. Инокулировать S. aureus RN4220 из замороженного сырья, хранящегося при -80 °C в 25% глицерине, в 30 мл бульона B2 в колбе объемом 250 мл и инкубировать в течение 18 ч при 30 °C, встряхивая при 125 об/мин.
    3. Инкубируйте две перегородки объемом 250 мл с 50 мл бульона B2 каждая при температуре 37 °C в течение ночи, чтобы предварительно нагреть среду на следующий день.
    4. На следующий день измерьте внешний диаметр600 ночного урожая. Добавьте достаточное количество культуры на ночь в каждую колбу, содержащую 50 мл бульона B2, чтобы получить итоговый OD600 0,25.
    5. Инкубировать при 37 °C, встряхивая при 250 об/мин, до тех пор, пока наружный диаметр600 не достигнет 0,35-0,4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте внешний диаметр600 примерно через 30 минут после субкультивирования, чтобы убедиться, что культура не вырастает выше 0,35-0,4. Если наружный диаметр600 не достигает 0,35-0,4 в течение 1 ч после субкультивирования, прекратите процедуру и повторите попытку на следующий день. Скорее всего, бактерии выросли слишком сильно за ночь и слишком глубоко погрузились в стационарную фазу.
    6. Как только культура достигнет средней логарифмической фазы, вылейте культуру из каждой колбы в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл и поместите грануляционные ячейки центрифугированием при давлении 4000 x g в течение 10 минут.
    7. Сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл стерильной воды комнатной температуры (RT). Переложите ячейки в микроцентрифужную пробирку.
    8. Снова центрифугируйте клетки при 21 000 x g в течение 30 с, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в 1 мл стерильной RT-воды. Повторите центрифугирование, удаление надосадочной жидкости и ресуспендирование в 1 мл воды еще два раза, всего три промывки.
    9. Центрифугируйте клетки, удалите воду, затем повторно суспендируйте клетки в 1 мл стерильного RT 10% глицерина (в воде, стерильно отфильтрованной) и оставьте на RT на 15 минут.
    10. Гранулируйте клетки центрифугированием при давлении 21 000 x g в течение 30 с, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки еще в 1 мл стерильного RT 10% глицерина. Эти элементы теперь являются электрокомпетентными.
    11. Аквотируйте 70 мкл электрокомпетентных элементов в микроцентрифужные пробирки с защелкивающимися крышками и храните при температуре -80 °C для дальнейшего использования.
    12. Чтобы преобразовать электрокомпетентный S. aureus RN4220, разморозьте аликвоту клеток на льду. Добавьте 1 г плазмидной ДНК в клетки, перемешайте образец и инкубируйте на льду в течение 5 минут. Затем электропорируют элементы и дают им восстановиться в 390 мкл среды B2 в течение 1-2 ч при 37 °C, встряхивая при 225 об/мин, и пластинчатые трансформанты на селективном триптическом соевом агаре.
      Примечание: Большинство челночных векторов, использованных в данном исследовании, имеют ампициллин-резистентную кассету для селекции в E. coli (100 мкг/мл) и хлорамфеникол-(10 мкг/мл) или эритромицин-резистентную (Erm, 10 мкг/мл) кассету для отбора в S. aureus. Многие штаммы S. aureus , которые обычно используются в лаборатории, устойчивы к Erm. Убедитесь, что интересующий вас штамм совместим с селективным антибиотиком, прежде чем использовать данный челночной вектор. Важно, чтобы объем добавляемой в клетки ДНК был сведен к минимуму (т. е. <5 мкл), чтобы предотвратить образование дуги, которая возникает, когда образец становится слишком проводящим во время электропорации. Очистка высоких концентраций (≥300 нг/мкл) плазмидной ДНК из E. coli поможет сохранить низкие объемы.
  2. Размножение бактериофага на трансформированных S. aureus РН4220.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий раздел протокола был адаптирован из методов Крауса и Бозе21и Олсон22. Два наиболее часто используемых бактериофага для S. aureus Трансдукция φ11 и 80α. Процедура сбора урожая одинакова, за исключением того, что мы получаем φ11 из S. aureus RN451 и 80α из S. aureus RN10359. φ11 был успешно использован с распространенными штаммами JE2 и HG003, среди прочих, и используется в этом протоколе23,24. Однако эти фаги не могут эффективно трансдуцировать клинические изоляты, которые имеют различную фаговую резистентность. Обратитесь к публикациям Крауса и Бозе21 и Олсон22 для способа получения φ11 и определения титра фагов.
    1. Для трансдукции репортерной плазмиды готовят шесть триптических соевых агаровых пластин (ТСА) с 5 мМ CaCl2и соответствующей концентрацией селективного антибиотика. Streak S. aureus RN4220 трансформируется с помощью репортерной плазмиды на планшет TSA, содержащий селективный антибиотик и не содержит CaCl2 , и инкубируется в течение ночи.
    2. На следующий день включите инкубатор или водяную баню до 56 °C. Нанесите этикетку на шесть пробирок объемом 5 мл с защелкивающимися крышками от 1 x 104 до 1 x 109 и добавьте 40 мл 500 мМ CaCl2 в каждую пробирку с защелкивающейся крышкой.
    3. Растопите мягкий TSA (0,5% агара) в микроволновой печи с ослабленной крышкой, чтобы предотвратить повышение давления при сохранении стерильности. Затем добавьте по 4 мл в каждую из пробирок с защелкивающимися крышками. Переверните пробирки для перемешивания, затем поместите их в инкубатор с температурой 56 °C, чтобы мягкий агар не затвердел.
    4. Разведите фаговый бульон до 1 x10 10 PFU/мл в триптическом соевом бульоне (TSB) + 5 мМ CaCl2. Добавьте 100 мкл 1 x10 10 БОЕ/мл фага в микроцентрифужную пробирку, содержащую 900 мкл TSB + 5 мМ CaCl2 для получения конечной концентрации 1 x 109 БОЕ/мл. Затем последовательно разбавляют в дополнительных микроцентрифужных пробирках, содержащих 900 мкл TSB + 5 мМ CaCl2до концентрации 1 x 104 PFU/мл. Промаркируйте каждую из шести тарелок TSA + 5 mM CaCl2 + селективный антибиотик с агаровым препаратом с серийным разведением: от 1 x 104 до 1 x 109 PFU/мл.
    5. Ресуспендируйте на ночь S. aureus RN4220, содержащий плазмиду, в 1 мл TSB + 5 мМ CaCl2. Извлеките из инкубатора пробиркус защелкивающимися крышками 10 9 и быстро добавьте 10 мкл ресуспендированного RN4220, содержащего плазмиду, и 100 мкл 1 x 109 PFU/мл фагового разведения, переверните для смешивания и вылейте содержимое на соответствующую агаровую пластину TSA + 5 мМ CaCl2 + селективный антибиотик агаровый планшет.
    6. Выполните эту процедуру для остальных фаговых разведений и соответствующих им планшетов. Дайте мягкому агару застыть на пластинах, затем инкубируйте мягким агаром лицевой стороной вверх в течение ночи при температуре 37 °C.
    7. На следующий день убедитесь, что на табличках видны бляшки (участки просвета на бактериальном газоне) (рисунок 2A). Бляшки представляют собой участки лизиса, в которых фаг успешно инфицировал RN4220, и некоторое количество фагов может занять интересующую плазмиду. Выберите планшет с наименее разбавленным фаговым материалом, который имеет почти сливающийся лизис (пример: 1 x 109 PFU/мл фаг), а также планшеты, которые получали два разведения ниже этого уровня (в этом случае 1 x 108 PFU/мл и 1 x 107 PFU/мл, которые должны иметь почти сливающийся лизис).
    8. Добавьте 3 мл TSB + 5 мМ CaCl2 к наименее разбавленной из этих пластин (1 x 109 PFU/мл, для этого примера). С помощью стерильного разбрасывателя L-образных клеток аккуратно соскребите слой мягкого агара с обычного агара (Рисунок 2B). Используйте разбрасыватель клеток, чтобы нарушить работу агара как можно сильнее, чтобы облегчить высвобождение фага из мягкого агара.
    9. После того, как мягкий агар на первой пластине будет полностью разрушен, аккуратно вылейте мягкий агар и бульонную кашицу на следующую тарелку (в данном случае 1 x 108 БОЕ/мл). Соскребите и разломайте мягкий агар на этой пластине, затем вылейте полученную кашицу на итоговую пластину и повторите.
    10. После приготовления мягкой агаровой кашицы из всех трех пластин аккуратно вылейте кашицу в коническую пробирку объемом 50 мл. Осторожно пипеткайте, чтобы еще больше разрушить мягкий агар, но избегайте образования пузырьков. Не стоит делать вихри, так как это может повредить фаг и снизить титр.
    11. Центрифугируйте мягкую агаровую суспензию при давлении 4 000 x g в течение 10 минут при RT. Аккуратно влейте надосадочную жидкость в шприц, подключенный к фильтру 0,45 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно лить аккуратно и не допускать попадания кусочков агара в фильтр. Эти кусочки будут засорять фильтр и препятствовать фильтрации оставшейся надосадочной жидкости, снижая титр.
    12. Определяют титр полученного лизата фага с помощью RN422021 дикого типа.
  3. Введение репортерных плазмид в интересующие штаммы S. aureus путем трансдукции.
    1. Приготовьте восемь планшетов TSA, содержащих 500 мкг/мл цитрата натрия и соответствующую концентрацию селективного антибиотика. Плотно насыпьте желаемый реципиент S. aureus на обычный TSA и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
    2. На следующий день возьмите тампон с планшета и повторно суспендируйте штамм-реципиент в 1 мл TSB + 5 мМ CaCl2.
    3. Разбавьте фаговую массу, несущую нужную репортерную плазмиду, до 1 х1010 БОЕ/мл.
    4. Смешайте 1,5 мл TSB + 5 мМ CaCl2, 0,5 мл ресуспендированного штамма-реципиента и 0,5 мл разведенного фагового запаса в конической пробирке объемом 50 мл. Инкубировать при температуре 37 °C, встряхивая при 225 об/мин, в течение 20 минут.
      Примечание: Более длительное время инкубации не рекомендуется, потому что оно, вероятно, снизит эффективность трансдукции, поскольку фаг начинает лизировать клетки-реципиенты.
    5. Сразу после этого добавьте 1 мл стерильно отфильтрованного ледяного 0,02 М цитрата натрия (в воду) в коническую пробирку и центрифугируйте при температуре 4000 x g в течение 10 минут при 4 °C. Затем повторно суспендируйте гранулу в 1 мл ледяного 0,02 М цитрата натрия.
    6. Распределите по 100 мкл аликвот на каждый из шести планшетов TSA, содержащих 500 мкг/мл цитрата натрия и соответствующую концентрацию селективного антибиотика для выбора трансдукторов. Инкубировать в течение ночи при 37 °C.
    7. На следующий день распределите отдельные колонии из трансдукционных планшетов на оставшиеся два планшета TSA, содержащие 500 мкг/мл цитрата натрия и соответствующую концентрацию селективного антибиотика. Инкубировать в течение ночи при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап пропускания на дополнительных цитратных планшетах натрия помогает уменьшить титр фага вокруг трансдуцированных клеток, предотвращая лизис22.
    8. Выберите отдельные колонии из полосовой пластины, вырастите клетки до экспоненциальной фазы в TSB, содержащем селективный антибиотик, и храните 25% глицерина при -80 °C для дальнейшего использования.

2. Получение флуоресцентных репортерных штаммов  P. aeruginosa путем конъюгации

Примечание: Перемещение репортерной плазмиды в P. aeruginosa из клонирующего штамма E. coli может быть осуществлено путем спаривания трех родителей25. Требуется донорский штамм E. coli , несущий представляющую интерес плазмиду (которая должна содержать oriT для конъюгального переноса), E. coli HB101 + pRK2013 - вспомогательный штамм для облегчения конъюгации (используйте 50 мкг/мл канамицина для поддержания плазмиды pRK2013), и реципиентный штамм P. aeruginosa, который получит плазмиду. В данном примере интересующая плазмида имеет маркер устойчивости к тетрациклину (Tet), поэтому любой культуре E. coli с плазмидой потребуется 10 мкг/мл Tet, а P. aeruginosa с плазмидой потребуется 75 мкг/мл Tet для выбора26.

  1. Инокулируйте бактерии из замороженных продуктов, хранящихся при температуре -80 °C в 25% глицерине, в лизогенный бульон (LB) с соответствующим антибиотиком для ночного роста, встряхивая при 225 об/мин при 37 °C.
  2. На следующий день распределите по 200 мкл каждой жидкой культуры на ночь на агаровую пластину LB с соответствующим селективным антибиотиком. В зависимости от того, сколько трансформационных спариваний предстоит провести, разложите больше пластин для хелпера и донорских штаммов. Рекомендуется одна тарелка помощника/донора на одну трансформацию. Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 °C, чтобы получить густые газоны каждого штамма.
  3. На следующий день соберите газоны с произрастания, протерев стерильным ватным тампоном поверхность каждой пластины и протерев его вдоль внутренней стороны микроцентрифужной трубкой. Центрифугируйте каждую пробирку кратковременно (импульс в течение 5 с), чтобы собрать клетки на дно пробирки. Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 200 мкл LB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Суспензии должны выглядеть очень густыми, непрозрачными и не иметь комочков.
  4. В новых микроцентрифужных пробирках для каждого спаривания соедините 5 мкл реципиентного штамма P. aeruginosa , 160 мкл донорского штамма E. coli , несущего интересующую плазмиду, и 160 мкл хелпера E. coli HB101 + pRK2013. Осторожно перемешайте, пипетируя вверх и вниз, затем нанесите 50 μL смеси на предварительно высушенную пластину с агаром LB. Кроме того, нанесите 20 мкл каждого отдельного штамма на агар LB для контроля. Дайте пятнам полностью высохнуть в тарелке, затем выдерживайте при 37 °C в течение 3-6 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительная сушка агара LB предотвращает растекание пятна объемом 50 мкл по поверхности и, таким образом, заставляет клетки взаимодействовать на меньшей площади.
  5. После инкубации осторожно проведите наконечником пипетки по месту сопряжения, чтобы перенести некоторые клетки в новую микроцентрифужную пробирку. Центрифуга кратковременно соберет клетки на дне пробирки. Ресуспендируйте в 200 мкл LB и наложите всю ресуспендию на агаровую пластину LB + Irgasan (Igr; 25 μг/мл) + Tet (75 μg/мл).
    Примечание: P. aeruginosa по своей природе устойчива к играсану, а интересующая плазмида содержит маркер устойчивости к Тету, поэтому только успешно трансформированный P. aeruginosa должен иметь возможность расти на пластинах LB + Иргасан + Тет. В зависимости от эффективности трансформации, ресуспензия и покрытие всего места стыковки может привести к образованию газона из трансформантов уже на следующий день. Для получения отдельных колоний либо (i) ресуспендировать все место спаривания в большем объеме LB, а затем насадить его на 200 мкл, либо (ii) перенести небольшую часть пятна спаривания в микроцентрифужную пробирку, а затем повторно суспендировать в 200 мкл и планшете.
  6. С помощью контрольных точек каждого отдельного штамма аккуратно нанесите часть плотного клеточного пятна на наконечник пипетки, перенесите в новую микроцентрифужную пробирку, повторно суспендируйте в 200 мкл LB, затем нанесите 50 мкл на агаровую пластину LB + Иргасан + Тет (несколько контрольных точек можно разместить на одной и той же агаровой пластине). Дайте пятнам полностью высохнуть. Инкубируйте все планшеты в течение 16-20 часов в течение ночи при температуре 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для контрольных точек цель состоит в том, чтобы убедиться, что антибиотик-планшет является селективным по трансформантам P. aeruginosa . Если контрольные пятна слишком сконцентрированы при обнаружении на пластинах агара LB + Иргасан + Тет, то будет сложно определить, сработала ли селекция на следующий день, потому что будет ореол мертвых клеток, которые можно принять за рост.
  7. На следующий день подтвердите антибиотическую селективность пластин LB + Irgasan + Tet, отметив отсутствие роста клеток для отдельных контрольных точек штамма.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии, которые появляются на трехродительской брачной пластине LB + Igrasan + Tet, являются трансформантами P. aeruginosa, несущими интересующую плазмиду.
  8. Опционально собирать и выращивать колонии на агаре LB + Irgasan + Tet и выращивать их в течение ночи, чтобы избавиться от лишних мертвых кишечных палочек из брачной смеси.
  9. Соберите отдельные колонии, выращивайте в течение 3-6 часов в жидком LB + Tet (75 мкг/мл) до заметного помутнения, затем законсервируйте замороженные запасы в 25% глицерина (500 мкл клеточной культуры + 500 мкл 50% глицерина в воде). Убедитесь, что клоны успешно трансформировались с помощью ПЦР колоний с последующим секвенированием по шкале Сэнгера или секвенированием всей плазмы.

3. Определение доз антибиотиков для персистентных анализов

Примечание: Чтобы выбрать дозу данного антибиотика для лечения бактериальной популяции в ходе настойчивых экспериментов, сначала измерьте минимальную ингибиторную концентрацию (MIC) антибиотика по отношению к интересующему бактериальному штамму. Это может быть достигнуто с помощью метода микроразведения бульона — подхода, одобренного Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI), или теста Эпсилометра (E-test), который проводится с использованием тест-полосок с диапазоном доз антибиотиков. После определения МПК выберите не менее пяти концентраций антибиотика, которые варьируются от 1 до 100 МПК для клеточного лечения.

  1. Инокулируйте бактерии из замороженных материалов, хранящихся при температуре -80 °C в 25% глицерине, в 2 мл катионно-скорректированного МГВ (CA-MHB) или другой среды, богатой питательными веществами. Выращивайте клетки в течение примерно 4 ч при 37 °C с встряхиванием при 250 об/мин перед переносом 125 мкл культуры в 25 мл свежей, химически определенной среды в колбе Эрленмейера объемом 250 мл. Выращивайте бактерии в течение 16 ч (до неподвижной фазы) при 37 °C, встряхивая при 250 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Базальные солевые среды (BSM) с сукцинатом в качестве единственного источника углерода обычно используются для экспериментов с P. aeruginosa, а богатые химически определенными средами обычно используются для экспериментов с S. aureus 28,29,30,31.
  2. На следующее утро приготовьте 100-кратное количество антибиотиков (в соответствующих растворителях) для желаемого диапазона над-MIC концентраций. Добавляйте по 10 мкл каждого разбавления в отдельные пробирки.
  3. Измерьте наружный диаметр600 ночного посева для подтверждения помутнения в стационарной фазе. Последовательно разведите 10 мкл культуры и нанесите разведения на питательные агаровые планшеты, такие как агар LB, AGAR CA-MHB или TSA, чтобы определить колониеобразующие единицы (КОЕ) до начала лечения антибиотиками.
  4. Для лечения антибиотиками дозируйте 1 мл аликвот культуры в пробирки, содержащие 10 мкл 100-кратной концентрации антибиотика. Инкубируйте образцы при 37 °C, встряхивая при 250 об/мин, в течение времени, достаточного для уничтожения нестойких клеток в популяции, оставляя персистентных клеток единственными колониеобразующими клетками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность лечения может варьироваться в зависимости от эксперимента и тестируемого штамма бактерий. Как правило, S. aureus обрабатывают в течение 5 или 7 часов, а P. aeruginosa — в течение 7 или 24 часов. В целом, можно использовать любой момент времени во второй фазе анализа выживаемости, поскольку ожидается, что клетки, оставшиеся во второй фазе, будут персистентными.
  5. После лечения антибиотиками перенесите 100 мкл клеток из пробирок в микроцентрифужные пробирки, содержащие 900 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS). Гранулируйте клетки центрифугированием при RT при 21 000 x g в течение 3 минут. Удалите 900 мкл надосадочной жидкости и повторно суспендируйте гранулу в 900 мкл стерильного PBS. Повторите этап промывки по крайней мере еще раз, чтобы снизить остаточное количество антибиотиков до уровня ниже MIC.
  6. Последовательно разбавляйте культуру в 10 раз (шесть раз) и вносите по 10 мкл каждого разведения на питательные агаровые тарелки. Инкубируйте пластины при температуре 37 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте необработанные 96-луночные планшеты с круглым дном для серийного разведения и пластинчатые ячейки на квадратных агаровых планшетах с использованием многоканальной пипетки.
  7. На следующий день подсчитайте колонии при каждой концентрации антибиотика. График доли выживаемости (КОЕ в конце лечения/КОЕ до обработки) в зависимости от концентрации в логлинейном масштабе. Чтобы выбрать концентрацию препарата для будущих анализов стойкости, выберите концентрацию во второй фазе двухфазной кривой (Рисунок 3).

4. Визуализация клеток во время лечения антибиотиками или восстановления

  1. Подготовка агарозных прокладок и образцов клеток для покадровой визуализации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол подготовки образцов был разработан в качестве удобной для пользователя и экономически эффективной альтернативы традиционным методам «бутерброда» с агарозой14,16. Использование сменной чашки для покровного стекла позволяет избежать необходимости использования грязной смазки или лака для ногтей для герметизации образца, что может еще больше ограничить аэрацию образца. Агароза устанавливается в сменную чашку с уже установленным покровным стеклом, что обеспечивает надежную плоскую поверхность агарозы по сравнению с приготовлениями из агарозной прокладки от руки. В целом, этот метод позволил визуализировать образцы с улучшенной фокусировкой по всему полю зрения и в течение более длительной продолжительности благодаря стабильному увлажнению. Описанный здесь метод используется для визуализации бактерий во время лечения антибиотиками (Рисунок 4, Дополнительное видео 3и Дополнительное видео 4). Визуализировать персистентов во время их оживления и пробуждения после лечения антибиотиками (Рисунок 5, Дополнительное видео 5и Дополнительное видео 6), приготовьте агарозные прокладки со свежими питательными средами вместо отработанных сред и не добавляйте в прокладки антибиотики (за исключением тех, которые добавляются для поддержания плазмиды/выбора антибиотиков).
    1. Поместите стерильный покровный лист диаметром 30 мм (толщина #1,5) на дно основания из нержавеющей стали сменной формы («камеры»). Аккуратно вденьте вставку из поликарбоната в основание так, чтобы покровное стекло диаметром 30 мм образовывало основание камеры, и запечатайте его на месте, сжав прикрепленное силиконовое уплотнительное кольцо. Повторите этот шаг, чтобы подготовить дубликат камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется готовить дубликаты для каждого эксперимента в случае, если подготовка одной из камер является неоптимальной. Изготовленный на 3D-принтере перегородка прикрепляется к 30-миллиметровому покровному стеклу, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение подвижных клеток, таких как P. aeruginosa, и обеспечить ориентиры для мест расположения образцов. Файл STL для 3D-печати доступен в дополнительном файле 1.
    2. Приготовьте 1,5% агарозу в конической пробирке объемом 50 мл с использованием среды по выбору. Аккуратно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации клеток стационарной фазы во время лечения в качестве базовой среды используется бесклеточная отработанная среда из культуры в стационарной фазе на ночь. Как правило, агарозную среду готовят в виде 0,105 г агарозы в 7 мл среды для приготовления двух камер; Для каждой камеры требуется 2 мл агарозной среды, и избыток полезен для предотвращения образования пузырьков воздуха при пипетировании.
    3. Поместите конус объемом 50 мл в стеклянный стакан или держатель, безопасный для микроволновой печи (убедитесь, что крышка ослаблена). Грейте в микроволновой печи на высокой мощности, останавливаясь каждые 3-4 секунды для взбалтывания и перемешивания. Сделайте паузу и часто перемешивайте, чтобы агарозная смесь не пузырилась.
      1. После ~1 минуты общего нагрева проверьте, не осталось ли в смеси видимой агарозы, которая не растаяла. Если смесь равномерно прозрачная, дайте агарозной среде ненадолго остыть до ~60 °C перед добавлением каких-либо дополнительных лекарств или красителей. Аккуратно перемешивайте, чтобы не допустить образования пузырьков воздуха.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Йодид пропидия (16 мкМ для P. aeruginosa или 1,6 мкМ для S. aureus) может быть добавлен для визуализации потери жизнеспособности клеток.
    4. Быстро двигаясь, чтобы предотвратить затвердевание агарозного фильтрующего материала, нанесите пипетку 2 мл агарозного фильтрующего материала в камеру с покровным стеклом 30 мм. Аккуратно наложите стерильный покровный лист толщиной 25 мм (толщина #1,5) на агарозный фильтр в верхнем отверстии камеры; Это помогает предотвратить обезвоживание агарозной прокладки и обеспечивает плоскую верхнюю поверхность агарозы для оптимальной фазово-контрастной визуализации. Дайте прокладке застыть в течение 1-2 часов.
    5. После того как прокладка затвердеет, подготовьте клетки к визуализации, разбавив их до соответствующей разреженной плотности в PBS для визуализации отдельных клеток. Здесь элементы разбавляются до наружного диаметра600 0,01-0,05.
    6. На покровном листе диаметром 25 мм используйте перманентный маркер с тонким наконечником, чтобы отметить местоположение/идентичность каждого образца, посеянного на покровную крышку. Переверните камеру так, чтобы опорное кольцо из нержавеющей стали было обращено вверх, и осторожно удерживайте вставку из поликарбоната под ней, откручивая основание. Поместите основание из нержавеющей стали в сторону. Осторожно сдвиньте покровное стекло диаметром 30 мм с прокладки и выбросьте его.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите покровное стекло 30 мм, сдвинув горизонтально, и будьте осторожны, чтобы не вдавить на агарозную поверхность. Кроме того, избегайте работы над открытой агарозной поверхностью: любая пыль, которая попадет на нее, повлияет на качество изображения и потенциально может загрязнить контактную площадку.
    7. Ориентируясь по меткам на покровном листе диаметром 25 мм, нанесите 5 мкл разбавленных элементов в соответствующие места на агарозной прокладке. Добавьте три пятна по 5 мкл (при необходимости отрегулируйте, например, 4 пятна по 4 мкл и т. д.). Как только пятна полностью высохнут, слегка положите новый, стерильный покровный стекло диаметром 30 мм по центру прокладки.
    8. Возьмитесь за вставку из поликарбоната одной рукой, а другой медленно снова наденьте основание из нержавеющей стали на новый покровный стекло. Нарезания резьбы до упора пальцев достаточно, чтобы сжать силиконовое уплотнительное кольцо и герметизировать камеру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не затягивайте слишком сильно - если покровное стекло толщиной 30 мм на поверхности образца сжимается основанием из нержавеющей стали и многократно скручивается, элементы могут распространяться радиально, что может привести к перекрестному загрязнению образца.
    9. После того, как камера будет герметизирована, проверьте, не соприкасается ли агароза с поверхностью покровного стекла диаметром 30 мм; На этом этапе обычно происходит некоторый, но не полный, поверхностный контакт. Тупым концом пинцета или аналогичного инструмента осторожно надавите на покровное стекло диаметром 25 мм, пока агароза не будет равномерно касаться покровного стекла диаметром 30 мм по всей поверхности.
      ВНИМАНИЕ: Этот шаг может привести к поломке покровного стекла толщиной 25 мм при использовании чрезмерного усилия.
    10. После того, как агароза плотно прижата к покровному стеклу толщиной 30 мм, чтобы не осталось крупных пузырьков воздуха, подушечка готова к нанесению изображений.
  2. Установите микроскоп и сделайте снимок.
    1. Подготовьте микроскоп и камеру визуализации к контролю окружающей среды. Установите температуру в настольном инкубаторе и инкубаторе с большой камерой на 37 °C и включите камерный увлажнитель. Поместите один из препаратов агарозной прокладки в инкубатор на стадии и закройте инкубационную камеру, чтобы образец сбалансировался. Увлажняющая крышка инкубатора на ступеньке в этот момент остается открытой, чтобы избежать образования конденсата на 25-миллиметровом покровном стекле камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Усадка/расширение контактной площадки из-за изменения температуры может привести к смещению между временными точками, выходящим за пределы диапазона сканирования алгоритма автофокусировки. Перед визуализацией крайне важно отбалансировать агарозную подушечку до стабильной температуры, которая обычно занимает не менее 15 минут. Достаточный нагрев также предотвращает попадание конденсата на верхнюю крышку при установке увлажняющей крышки. Аппаратными компонентами системы визуализации являлись (Table of Materials): инкубационная камера живых клеток, инвертированный микроскоп с объективом Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27, светодиодный световой модуль Spectra 7 и камера sCMOS (размер пикселя 6,5 мкм). Управление моторизованными компонентами микроскопа и получение изображений осуществляется с помощью программного приложения для анализа микроскопии.
    2. Подготовьте программное обеспечение для получения изображений. Настройте встроенный алгоритм автофокусировки MetaMorph (программное обеспечение для микроскопического анализа) для использования фазового канала во время многомерной регистрации.
      1. На вкладке «Стадия » задайте несколько положений сцены для каждого образца, стремясь к полям обзора, в которых плотность ячеек равномерно распределена. На вкладке Таймлапс задайте желаемую продолжительность и частоту (интервал времени) изображений, которые будут сделаны. На вкладках Длины волн задайте нужные каналы для сбора данных и отрегулируйте время экспозиции для интенсивности сигнала сэмплов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения каждой позиции делаются каждые 10 минут в течение 24 часов. Для флуоресцентной визуализации красителей/флуорофоров, упомянутых в этой статье, использовались следующие настройки возбуждения светового двигателя: йодид пропидия (Cy3; 555/15 нм) и GFP (GFP/FITC; 470/24 нм). Типичное время экспозиции возбуждения флуоресценции, которое используется, составляет 100 мс. Используется фильтрующий комплект 15 (Beamsplitter FT580, Emission LP590) для йодида пропидия и фильтрующий комплект 44 (Beamsplitter FT500, Emission BP 530/50) для GFP.
    3. После того, как агарозная прокладка прогреется в камере, добавьте увлажняющую крышку в инкубатор на стадии стола. Это поможет предотвратить обезвоживание и смещение подушечки во время визуализации.
    4. Надев увлажняющую крышку, переключитесь с фазового на дифференциально-интерференционный контраст (DIC) и отрегулируйте конденсор и апертурную диафрагму микроскопа для правильного освещения по Келеру.
    5. После регулировки переключитесь обратно в фазу. Перейдите к каждому положению рабочей области, отрегулируйте фокус и сбросьте положение рабочей области в новую фокальную плоскость. Теперь все готово для начала визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно пересмотреть положение каждой ступени перед началом съемки, чтобы убедиться, что площадка не сместилась. Если при повторном посещении ячеек в определенном положении этапа находятся не в фокусе, повторно сфокусируйтесь на них и переопределите предыдущее положение этапа. Настройка алгоритма автофокусировки использует z-положение фокуса от последней временной точки ± 3 мкм в качестве диапазона поиска, поэтому если контактная площадка сместится более чем на 3 мкм, то алгоритм не сможет сфокусироваться должным образом.
    6. Запустите многомерный сбор данных, нажав кнопку Приобретение .
    7. После завершения эксперимента скомпилируйте отдельные изображения с каждого канала в стек для просмотра в виде видео или для другого анализа. Сделайте это с помощью MetaMorph или ImageJ.
      1. Чтобы скомпилировать изображения в MetaMorph (предпочтительно), в приложении Review Multi Dimensional Data выберите интересующие каналы/длины волн и выберите все временные точки для заданного положения сцены. Нажмите кнопку Загрузить изображения. Для каждого канала/длины волны появятся окна. Сохраните каждую компиляцию с соответствующим именем канала в виде файла .tiff.
      2. Чтобы скомпилировать в ImageJ, откройте файлы для всех временных точек для одной позиции сцены и одного канала. Компилируйте с помощью Images to Stack.

5. Создание покадровых видео с помощью Fiji/ImageJ

ПРИМЕЧАНИЕ: Фиджи (Фиджи - это просто ImageJ) - это свободно доступное программное обеспечение для обработки и анализа изображений, которое можно скачать здесь: "https://imagej.net/software/fiji/downloads32"32. Fiji/ImageJ2 1.54f использовался для методов обработки изображений, описанных ниже.

  1. Коррекция оттенков стека изображений фазового канала с помощью BaSiC33. Откройте нужный стек изображений фаз на Фиджи, а затем выберите BaSiC на вкладке Плагины . Откорректированный стек появится в отдельном окне под названием Corrected:ImageName.
    ПРИМЕЧАНИЕ: BaSiC.jar можно скачать здесь: "https://github.com/marrlab/BaSiC33"33. Следуйте инструкциям разработчика для правильной установки BaSiC на Фиджи.
  2. Объедините стек фазовых каналов с коррекцией оттенка с любыми другими каналами/длинами волн с помощью функций «Изображение > цвет» > «Объединить каналы». Отрегулируйте фон и интенсивность сигнала с помощью функции «Изображение» > «Настройка яркости/контрастности> для каждого канала. Сохраните объединенный файл как .tiff.
  3. Далее, стабилизируйте изображения с помощью инструмента Коррекция 3D Дрифта (Correct 3D Drift). Выбрав стек с коррекцией оттенка, перейдите в раздел Плагины > Регистрации > Коррекция 3D Drift. В открывшемся диалоговом окне установите в качестве канала для регистрации номер канала, соответствующий стеку фаз. Результирующий стек после коррекции будет назван зарегистрированными временными очками. Обрежьте до нужного поля зрения, затем сохраните исправленный файл как .tiff.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если для создания скомпилированного стека изображений использовался MetaMorph, то есть дополнительный шаг обработки: перейдите в Свойства изображения > и поменяйте местами номера в полях Срезы (z) и Рамки (t). Коррекция смещения теперь может правильно интерпретировать каждый кадр как временную точку, а не как срез z-стека. Файл .tiff с коррекцией оттенка и смещения может быть использован для последующего анализа изображений. Существует множество программных пакетов для измерения интенсивности флуоресцентного сигнала, количественной оценки морфологических характеристик, отслеживания судьбы отдельных клеток и многого другого. Две наиболее часто используемые программы - это плагин MicrobeJ для Фиджи и Oufti34,35.
  4. Добавьте временные метки и текстовые метки в стопку с помощью Image > Stacks > Label.
  5. Чтобы добавить масштабную линейку, сначала узнайте размер пикселя камеры и увеличение объектива микроскопа. Рассчитайте соотношение пикселей и микрон как размер пикселя, деленный на увеличение. В диалоговом окне Анализ > установка масштаба введите отношение пиксель:микрон в поле известного расстояния . Затем добавьте масштабную линейку в стек с помощью инструментов «Анализ >» > «Масштабная линейка».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точный масштаб микроскопа должен быть откалиброван с помощью предметного микрометра. Тем не менее, используемый объектив микроскопа и камера могут дать приблизительную оценку масштаба. Например, использованная здесь камера PCO sCMOS имеет размер пикселя 6,5 x 6,5мкм2, а для визуализации использовался объектив 63x, поэтому размер пикселя, разделенный на увеличение, составляет 6,5/63 = 0,1032 мкм на пиксель. Введите 0,1032 в поле «Известное расстояние » в диалоговом окне «Задать масштаб ».
  6. Чтобы экспортировать готовый стек изображений в виде видео, которое можно воспроизвести в QuickTime Player, Microsoft PowerPoint и т. д., сохраните как файл .avi.

Результаты

Об успешном введении репортерных плазмид в P. aeruginosa и S. aureus свидетельствует рост на правильных селективных антибиотиках и может быть подтверждено ПЦР и/или секвенированием колоний. Модифицированные штаммы должны быть верифицированы как фенотипические репортеры путем воздействия на них условий, в которых, как известно, индуцируется интересующий их ген, а результирующая флуоресценция может быть измерена с помощью проточной цитометрии, спектрофотометрии или эпифлуоресцентной микроскопии (рис. 1).

Чтобы облегчить выбор дозы (доз) антибиотика, которая будет использоваться для последующих экспериментов, проведите зависимые от концентрации анализы персистентных антибиотиков для представляющих интерес штаммов P. aeruginosa или S. aureus . Концентрационно-зависимые анализы обычно приводят к двухфазной кривой с крутым начальным наклоном при более низких концентрациях антибиотиков и плато или менее крутым склоном при более высоких концентрациях. Однако для некоторых пар антибиотик-вид отчетливая двухфазная кривая может не получиться. Например, кривая для S. aureus dэлафлоксацина явно двухфазна (рис. 3A), а кривая левофлоксацина P. aeruginosa — нет (рис. 3B)15. В этом сценарии мы выберем концентрацию, которая по крайней мере в 10 раз превышает МПК (например, 5 мкг/мл, что примерно в 15 раз превышает МПК для P. aeruginosa)15. Однако, поскольку 15-кратное применение левофлоксацина MIC приводит только к ~0,001% выживаемости P. aeruginosa , мы используем лечение левофлоксацином в дозе 1 мкг/мл, если хотим увидеть персистенции при визуализации клеток по мере их восстановления на агарозных прокладках без антибиотиков (Дополнительное видео 6); В противном случае количество полей зрения, необходимых для отображения нескольких персистентов, становится непомерно большим.

В начале визуализации идеальный образец и препарирование агарозной прокладки должны быть плоскими по всему полю зрения, без крупного мусора, морщин или пузырьков воздуха, а также с равномерно распределенными отдельными клетками. Получение хорошо распределенных одиночных клеток может потребовать оптимизации разведения или ресуспендирования образца. У S. aureus клетки имеют тенденцию образовывать небольшие кластеры и должны быть тщательно перемолоты перед посевом на агарозную подушечку (рис. 4 и рис. 5). Для P. aeruginosa клетки могут образовывать агрегаты, заключенные в липкий внеклеточный матрикс в суспензии; Необходимо тщательно пипетировать эти образцы и разрушать агрегаты для визуализации отдельных клеток.

После завершения эксперимента по визуализации успешная покадровая съемка изображений будет отображаться в фокусе, стабильно освещена и с минимальным дрейфом в плоскости x-y на протяжении всего эксперимента. Дополнительный видеосигнал 7 представляет собой оптимальное получение изображения: t – фазовый канал дополнительного видеосигнала 4 перед коррекцией тени или дрейфа. Потеря фокуса может произойти, если конденсация (из-за чрезмерного увлажнения или недостаточного нагрева образца) приводит к образованию капель воды на верхнем 25-миллиметровом покровном стекле, искажая свет и выталкивая фокальную плоскость за пределы максимального диапазона поиска алгоритма автофокусировки (Дополнительное видео 8). Колебания освещенности обычно указывают на недостаточное количество масла для погружения в момент съемки. Если сцена движется слишком быстро, масло на объективе может отставать и все еще догонять при получении изображений. Это можно уменьшить, настроив элементы управления захватом для замедления скорости движения или добавив паузу между перемещением в следующее положение и получением изображения. Основной дрейф образца будет выглядеть как множество клеток, скользящих по полю зрения, в то время как некоторые из них остаются на месте (Дополнительное видео 9). Обычно это происходит позже в экспериментах, потому что агарозная прокладка обезвоживается из-за недостаточного контроля влажности. Препарат агарозной прокладки, представленный в этой статье, был разработан для обеспечения стабильности образца, но для оптимального получения изображения необходимо надлежащее нагревание/увлажнение образца и окружающей его среды.

figure-results-4888
Рисунок 1: Флуоресцентные репортерные штаммы освещают экспрессию интересующего гена. (A) S. aureus трансдуцировали с помощью транскрипционного репортера GFP для гена, представляющего интерес в соответствии с протоколом 1. Репортерный штамм обрабатывали антибиотиком в течение 24 ч, промывали PBS, а затем высаживали на агарозную прокладку, изготовленную из CA-MHB плюс йодид пропидия (1,6 мкМ) и хлорамфеникол (10 мкг/мл для поддержания репортерной плазмиды) для визуализации во время восстановления (Дополнительное видео 1). (B) P. aeruginosa трансформировали с плазмидой, несущей mScarlet-linked трансляционный репортер для белка, представляющего интерес26. Репортерный штамм обрабатывали антибиотиком в течение 5 ч, промывали PBS, а затем высаживали на агарозную прокладку, изготовленную из BSM плюс Tet (75 мкг/мл; для поддержания репортерной плазмиды) для визуализации во время восстановления (Дополнительное видео 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6284
Рисунок 2: Размножение и сбор бактериофага. (A) На шести пластинах показано шесть различных количеств разведенного фагового запаса на газонах S. aureus RN4220. Красными контурами обозначены три пластины, которые будут собраны, начиная с пластины с наибольшей расчисткой (жирный красный контур; 1 x109 PFU/мл) до следующих двух разведений (1 x 108 и 1 x 107 PFU/мл). Черные стрелки указывают на отдельные бляшки. (B) Чтобы собрать фаг из планшетов, соскребите слой мягкого агара (слева), перенесите суспензию на следующую пластину для разведения (в центре) и, собрав вместе мягкий агар из всех трех планшетов, объедините в коническую пробирку для центрифугирования (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7396
Рисунок 3: Репрезентативные анализы персистентных веществ, зависящие от концентрации. Концентрационно-зависимая персистенция фторхинолонов оценивалась в стационарной фазе (A) S. aureus (против делафлоксацина) и (B) P. aeruginosa (против левофлоксацина). В последующих экспериментах использовали 5 г/мл делафлоксацина (красный круг), потому что при этой концентрации уничтожение S. aureus стабилизировалось. Для последующих экспериментов с P. aeruginosa будет использована доза левофлоксацина не менее 1 мкг/мл (красный кружок). Обратите внимание, что уничтожение бактерий не является плато для P. aeruginosa, но все же существует менее крутая «вторая фаза» двухфазной кривой, которая указывает на устойчивую субпопуляцию. Панель 3B была адаптирована с разрешения Hare et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8657
Рисунок 4: Визуализация бактериальных фенотипов во время лечения антибиотиками. Клетки стационарной фазы (A) S. aureus и (B) P. aeruginosa высевали на агарозные прокладки, содержащие антибиотики фторхинолонов, и контролировали во время лечения: 5 мкг/мл делафлоксацина для S. aureus (Дополнительное видео 3) и 5 мкг/мл левофлоксацина для P. aeruginosa (Дополнительное видео 4)15. Йодид пропидия (PI; 16 мкМ для P. aeruginosa, 1,6 мкМ для S. aureus) добавляли в прокладки для маркировки мертвых или умирающих клеток. Клетки S. aureus остаются в значительной степени неповрежденными и живыми в присутствии FQ, в то время как большинство клеток P. aeruginosa претерпевают радикальные морфологические изменения, в том числе образуют круглые сферопласты, прежде чем они лизируются и умирают. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-9970
Рисунок 5: Отслеживание популяций персистентов во время выздоровления. (A) S. aureus и (B) P. aeruginosa высевали на агарозные прокладки, содержащие свежие среды, после того, как они были обработаны фторхинолонами (5 мкг/мл делафлоксацина для S. aureus и 1 мкг/мл левофлоксацина для P. aeruginosa) и контролировались во время их восстановления после лечения (Дополнительное видео 5 и Дополнительное видео 6). Видимые перисестры обозначены зелеными стрелками в первых двух кадрах на каждой панели, и они остались неповрежденными и жизнеспособными во время лечения антибиотиками. После начального периода задержки персистенты начали делиться и давать начало новому потомству (обозначено зелеными кружками). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-11141
Рисунок 6: Подготовка образцов с помощью микроскопа. (A) Схема рабочего процесса пробоподготовки с использованием сменной чашки («камеры»). (В) Изображение разобранной камеры и ее отдельных компонентов. (В) Изображение полностью собранной камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительное видео 1: S. aureus persister. Видеофайл, содержащий изображения на рисунке 1A. Короче говоря, S. aureus , несущий транскрипционный репортер GFP для интересующего гена, в течение 24 ч обрабатывали антибиотиком, промывали PBS, а затем засеивали на агарозную прокладку, изготовленную из CA-MHB плюс йодид пропидия (1,6 мкМ) и хлорамфеникол (10 мкг/мл) для визуализации во время восстановления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительное видео 2: P. aeruginosa persister. Видеофайл, содержащий изображения на рисунке 1B. Короче говоря, P. aeruginosa, несущая связанный с mScarlet трансляционный репортер для представляющего интерес белка, обрабатывалась антибиотиком в течение 5 ч, промывалась PBS, а затем высаживалась на агарозную прокладку, изготовленную из BSM плюс Tet (75 мкг/мл) для визуализации во время восстановления26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительное видео 3: S. aureus во время лечения антибиотиками. Культуру стационарной фазы S. aureus , выращенную в богатых химически определенных средах, засевали в агарозные прокладки, изготовленные из бесклеточных кондиционированных сред культуры с йодидом пропидиума (1,6 мкМ) и делафлоксацином (5 мкг/мл). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительное видео 4: P. aeruginosa во время лечения антибиотиками. Стационарно-фазовую культуру P. aeruginosa, выращенную в BSM, высевали в агарозные подушечки, изготовленные из бесклеточных кондиционированных сред из культуры P. aeruginosa, выращиваемой в BSM параллельно; агарозная прокладка также содержала йодид пропидия (16 мкМ) и левофлоксацин (5 мкг/мл). Это видео было адаптировано с разрешения Hare et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительное видео 5: S. aureus во время восстановления после антибиотиков. S. aureus выращивали до неподвижной фазы в богатых химически определенных средах. Культуры стационарной фазы обрабатывали 5 мкг/мл делафлоксацином в пробирках в течение 24 ч, промывали PBS, а затем засеивали в безантибиотиковые агарозные прокладки CA-MHB, содержащие йодид пропидия (1,6 мкМ) для визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительное видео 6: P . aeruginosa во время восстановления после антибиотиков. Стационарно-фазовую культуру P. aeruginosa, выращенную в BSM, обрабатывали 1 мкг/мл левофлоксацина в пробирках в течение 7 ч, промывали PBS, а затем засеивали в не содержащие антибиотиков агарозные прокладки BSM, содержащие йодид пропидия (16 мкМ) для визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительное видео 7: Пример оптимального получения изображения. Это видео является фазовым каналом дополнительного видео 4 перед обработкой изображения в качестве примера оптимальной цейтраферной съемки. Обратите внимание на минимальный дрейф, стабильное освещение и поддержание фокусировки на протяжении всего эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительное видео 8: Пример неоптимального получения изображения из-за конденсации. В этом видео показана часть эксперимента, в котором на получение изображения повлияла плохая фокусировка, вероятно, из-за конденсации в камере из-за неправильного нагрева образца и/или чрезмерного увлажнения среды визуализации. Образец, который был визуализирован, был обработан левофлоксацином P. aeruginosa во время восстановления после антибиотиков на агарозной прокладке BSM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительное видео 9: Пример неоптимального получения изображения из-за дрейфа. В этом видео показана часть эксперимента, в котором на получение изображения влиял дрейф образца, вероятно, из-за обезвоживания и сжатия/подъема агарозной прокладки с покровного стекла. Образцом был P. aeruginosa на агарозной подушечке, содержащей левофлоксацин и йодид пропидия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительный файл 1: 25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Мы обнаружили, что успех эксперимента с покадровой микроскопией зависит от качества агарозных подушечек и их стабильности на протяжении всего процесса визуализации. Агарозные прокладки из нержавеющей стали, закрытые камерой, относительно просты в изготовлении, что приводит к стабильно плоским образцам, которые можно стабильно визуализировать в течение десятков часов. Это позволяет визуализировать десятки тысяч клеток в одном эксперименте и увеличивает вероятность обнаружения редких фенотипических вариантов, таких как персистентные клетки, в популяции.

Этот метод приготовления агарозной подушечки представляет собой легко реализуемую альтернативу ранее опубликованным методам. Наш протокол не требует технической точности изготовления микрофлюидных устройств или ловких манипуляций с методами агарозного «сэндвича», что облегчает достижение последовательной подготовки от прогона к прогону 14,16,36. Кроме того, система является экономически эффективной. Камера из нержавеющей стали является стерилизуемой и многоразовой (в отличие от одноразовых пластиковых камер), а для установки не требуется специализированное оборудование16,37. Камера легко устанавливается на различные системы микроскопии с использованием имеющихся в продаже сценических вкладышей. Кроме того, поскольку бактерии иммобилизуются на границе раздела агарозного стекла и крышки, мы добились успеха в отслеживании высокоподвижных бактерий, таких как P. aeruginosa, при этом сохраняя возможность морфологических изменений (Рисунок 4, Дополнительное видео 4). Другие методы визуализации одиночных клеток, такие как «материнская машина», ограничивают клетки каналами, которые исключают наблюдение за морфологическими изменениями, отличными от филаментации.

Для успешной работы с этим протоколом необходимо помнить о некоторых важных шагах и параметрах. Для приготовления подушечек важно тщательно нагреть и расплавить агарозу, так как любые оставшиеся кристаллы агарозы вызовут дифракцию света и повлияют на качество изображения. Точно так же нужно следить за тем, чтобы пипетка из агарозы попадала в камеру, не вводя пузырьков воздуха. Чтобы обеспечить постоянную толщину агарозных прокладок и ограничить снос образца, важно дать прокладке сбалансироваться (обычно в течение 15 минут) во влажном корпусе с регулируемой температурой до начала визуализации. Еще одним фактором, который может привести к ухудшению качества изображения, является контроль влажности: низкая влажность приведет к обезвоживанию и усадке агарозной прокладки, в то время как высокая влажность (или неправильный нагрев образца в камере) может привести к конденсации теплого воздуха на образце и искажению изображения. Пример неоптимальной покадровой съемки из-за конденсации можно найти в Дополнительном видео 8.

Ограничением текущей конфигурации является то, что питательные среды не могут быть заменены, что препятствует непрерывному отслеживанию отдельных бактерий до, во время и после лечения антибиотиками. Мы ожидаем, что соединение агарозной прокладки с проточными ячейками или микрофлюидными устройствами, которые обеспечивают обмен культуральными средами, может позволить отслеживать популяции во время изменений в питании или окружающей среде. Еще одним параметром текущей конструкции, который можно было бы улучшить, является аэрация образцов. Уплотнительное кольцо и завинчивающаяся верхняя часть сменной чашки обеспечивают лучшую аэрацию проб по сравнению с установками, требующими использования воска или герметика на основе смазки для герметизации прокладок16. Тем не менее, аэрация в герметичной камере все еще может быть ограниченной и может не способствовать росту облигатных аэробов, хотя это еще предстоит проверить.

Протокол подготовки образцов с интервальной съемкой, который мы представляем в этой статье, позволяет отслеживать тысячи бактерий, реагирующих на лечение антибиотиками или восстанавливающихся после него. Этот метод также очень обобщаем и имеет множество потенциальных применений, выходящих за рамки персистентной биологии. Например, установка агарозной прокладки и делителя позволяет засевать пространственно разделенные образцы клеток, но при этом обеспечивает межклеточную коммуникацию посредством диффузии через агарозную прокладку. В настоящее время мы изучаем потенциал этой установки для проверки того, как обмен секретируемыми продуктами влияет на рост клеток в многовидовых сообществах. Мы ожидаем, что этот протокол обеспечит низкий порог входа в покадровую микроскопию для нового исследователя и безграничные возможности для изучения опытным микробиологом.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарим г-жу Сьюзан Стауровски из Центра клеточного анализа и моделирования микроскопии UConn Health за ее помощь в проведении экспериментов по микроскопии. Мы благодарим доктора Мону Ву Орр и семинар «Основы стафилококковой генетики и метаболизма» за их протоколы и советы по клонированию P. aeruginosa и S. aureus соответственно. Эта работа была поддержана финансированием Национальных институтов здравоохранения (NIH; DP2GM146456-01 и 1R01AI167886-01A1 в W.W.K.M., 1F30DE032598-01A1 в P.J.H. и 1F31DK136259-01A1 в T.J.L.). Спонсоры не играли никакой роли в планировании наших экспериментов или подготовке этой рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BaSiCGitHubhttps://github.com/marrlab/BaSiC
Certified Molecular Biology AgaroseBiorad1613101
Fiji-ImageJNIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
Interchangeable Coverglass DishBioptechs190310-3535 mm ICD for preparing agarose pads; comes with 30 mm (#1.5) coverslips
Lumencor Spectra 7 LED light engineLumencorhttps://lumencor.com/products/spectra-light-engineSpectra 7 LED light engine
MetaMorphMolecular DevicesPremier version 7.10.5
pco.edge 4.2 bi sCMOS cameraExcelitashttps://www.excelitas.com/product/pcoedge-42-bi-usb-scmos-camerasCMOS camera
PeCon live cell incubation chamberpeConhttps://www.pecon.biz/
Thomas Scientific Round cover glass, #1.5 thickness, 25 mm, 100 packFisher ScientificNC127277025 mm (#1.5) coverslips
Zeiss Axiovert 200M microscopeZeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/widefield-microscopes/axiovert-for-materials.htmlInverted microscope with Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27 objective, Lumencor Spectra 7 LED light engine, and pco.edge 4.2 bi sCMOS camera (6.5 mm pixel size)

Ссылки

  1. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nat Rev Microbiol. 14, 320-330 (2016).
  2. Balaban, N. Q., et al. Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence. Nat Rev Microbiol. 17 (7), 441-448 (2019).
  3. Conlon, B. P. Staphylococcus aureus chronic and relapsing infections: evidence of a role for persister cells. Bioessays. 36 (10), 991-996 (2014).
  4. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  5. Verstraete, L., Van den Bergh, B., Verstraeten, N., Michiels, J. Ecology and evolution of antibiotic persistence. Trends Microbiol. 30 (5), 466-479 (2021).
  6. Sett, A., Dubey, V., Bhowmik, S., Pathania, R. Decoding bacterial persistence: Mechanisms and strategies for effective eradication. ACS Infect Dis. 10 (8), 2525-2539 (2024).
  7. Mempin, R., et al. Release of extracellular ATP by bacteria during growth. BMC Microbiol. 13, 301 (2013).
  8. Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nat Rev Microbiol. 5 (1), 48-56 (2006).
  9. Fauvart, M., De Groote, V. N., Michiels, J. Role of persister cells in chronic infections: clinical relevance and perspectives on anti-persister therapies. J Med Microbiol. 60 (pt 6), 699-709 (2011).
  10. Van den Bergh, B., Fauvart, M., Michiels, J. Formation, physiology, ecology, evolution and clinical importance of bacterial persisters. FEMS Microbiol Rev. 41, 219-251 (2017).
  11. Levin, B. R., Rozen, D. E. Non-inherited antibiotic resistance. Nat Rev Microbiol. 4 (7), 556-562 (2006).
  12. Davis, K. M., Isberg, R. R. Defining heterogeneity within bacterial populations via single cell approaches. Bioessays. 38 (8), 782-790 (2016).
  13. Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
  14. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. J Vis Exp. 53, e3145 (2011).
  15. Hare, P. J., Gonzalez, J. R., Quelle, R. M., Wu, Y. I., Mok, W. W. K. Metabolic and transcriptional activities underlie stationary-phase Pseudomonas aeruginosa sensitivity to levofloxacin. Microbiol Spectr. 12 (1), e0356723 (2024).
  16. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
  17. Pang, Y. Y., et al. agr-Dependent interactions of Staphylococcus aureus USA300 with human polymorphonuclear neutrophils. J Innate Immun. 2 (6), 546-559 (2010).
  18. Bose, J. L., Fey, P. D., Bayles, K. W. Genetic tools to enhance the study of gene function and regulation in Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol. 79 (7), 2218 (2013).
  19. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett. 73, 133-138 (1992).
  20. Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology. , (2016).
  21. Krausz, K. L., Bose, J. L. Bacteriophage Transduction in Staphylococcus aureus: Broth-Based Method. The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology. , (2016).
  22. Olson, M. E. Bacteriophage Transduction in Staphylococcus aureus. The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology. , (2016).
  23. Fey, P. D., et al. A genetic resource for rapid and comprehensive phenotype screening of nonessential Staphylococcus aureus genes. mBio. 4 (1), e00537-e00612 (2013).
  24. Coe, K. A., et al. Multi-strain Tn-Seq reveals common daptomycin resistance determinants in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 15 (11), e1007862 (2019).
  25. Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (4), 1648 (1979).
  26. Shee, C., et al. Engineered proteins detect spontaneous DNA breakage in human and bacterial cells. eLife. 2, e01222 (2013).
  27. Kowalska-Krochmal, B., Dudek-Wicher, R. The minimum inhibitory concentration of antibiotics: methods, interpretation, clinical relevance. Pathogens. 10 (2), 165 (2021).
  28. Robinson, J. L., Jaslove, J. M., Murawski, A. M., Fazen, C. H., Brynildsen, M. P. An integrated network analysis reveals that nitric oxide reductase prevents metabolic cycling of nitric oxide by Pseudomonas aeruginosa. Metab Eng. 41, 67-81 (2017).
  29. Wolff, J. A., MacGregor, C. H., Eisenberg, R. C., Phibbs, P. V. Isolation and characterization of catabolite repression control mutants of Pseudomonas aeruginosa PAO. J Bacteriol. 173 (15), 4700-4706 (1991).
  30. Batchelder, J. I., Taylor, A. J., Mok, W. W. K. Metabolites augment oxidative stress to sensitize antibiotic-tolerant Staphylococcus aureus to fluoroquinolones. mBio. , e0271424 (2024).
  31. Power, A. D., Mok, W. W. K. Agar and agarose used for Staphylococcus aureus biofilm cultivation impact fluoroquinolone tolerance. J Appl Microbiol. 135 (8), lxae191 (2024).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nat Commun. 8, 14836 (2017).
  34. Ducret, A., Quardokus, E., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat Microbiol. 1 (7), 16077 (2016).
  35. Paintdakhi, A., et al. Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
  36. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
  37. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

216Pseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены