Лабораторный тест на безопасность Prion

Резюме

Метод оценки часто используемых областей в лабораторных условиях на предмет прионного загрязнения и эффективной дезактивации отсутствует. Описанный здесь протокол обеспечивает ключевые основы для реализации лабораторного теста безопасности прионов, который может быть легко изменен в соответствии с индивидуальными потребностями конкретных лабораторий.

Аннотация

Передача ятрогенной прионной болезни происходит через загрязненные нейрохирургические инструменты, материалы для трансплантации и профессиональное воздействие лабораторных инструментов, загрязненных прионами. Прионы вызывают заболевание путем неправильного сворачивания нормальной клеточной формы прионного белка PrP^C в неправильно свернутую и патогенную форму PrP^Sc и неизменно приводят к летальному исходу. Сокращение ятрогенной и профессиональной передачи прионов является сложной задачей. Во-первых, прионы могут связываться с поверхностями и сохраняться на них в течение длительных периодов времени. Во-вторых, прионы обладают высокой устойчивостью к инактивации. Учитывая это, поверхности могут сохранять инфекционность в течение длительных периодов времени после неэффективного обеззараживания. Это не только может представлять потенциальный профессиональный риск для работников прионных лабораторий, но и потенциально может привести к перекрестному загрязнению лабораторных экспериментов с использованием чувствительных методов амплификации прионов. Описанный здесь протокол лабораторного теста на безопасность прионов включает в себя шаги по идентификации и документированию лабораторных зон с интенсивным движением, рекомендуемые меры контроля мазка для обеспечения достоверности результатов, шаги по определению надлежащих реакций на положительные участки поверхностного мазка, репрезентативные результаты тестирования прионных мазков, а также потенциальные артефактные результаты. В целом, лабораторное испытание на безопасность прионов может быть реализовано в рамках более широкой программы безопасности прионов для оценки обеззараживания поверхностей, мониторинга мест общего пользования на предмет загрязнения прионами и документирования статуса обеззараживания прионов.

Введение

Прионные болезни неизменно являются смертельными нейродегенеративными заболеваниями, лечение которых неизвестно. Прионные заболевания вызываются PrP^Sc, неправильно свернутой и патогенной формой нормальной клеточной формы прионного белка 1,2,3,4,5, PrP C. Известно, что прионные болезни поражают людей и некоторые другие виды животных. Одно из прионных заболеваний человека, болезнь Крейтцфельдта-Якоба, БКЯ, имеет три известные этиологии: спорадическая, наследственная и приобретенная. Приобретенная болезнь Крейцфельда-Якоба может возникнуть в результате случайной передачи (ятрогенной и профессиональной) и считается причиной Куру у народа Форе в Папуа-Новой Гвинее⁶.

Передача прионов была связана с загрязненными прионами медицинскими устройствами и материалами для трансплантации 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Ятрогенная передача болезни Крейцфельда-Якоба может происходить через кровь, ткани или с загрязненных прионами поверхностей 18,19,20. Например, ятрогенная болезнь Крейцфельда-Якоба может развиться у пациентов после электроэнцефалограммы с электродами, ранее использованными на человеке на доклинической стадии болезни Крейцфельда-Якоба, который затем умер от болезни Крейцфельда-Якоба²¹. Более поздняя профессиональная передача инфекции в лабораторных условиях также имела место, когда лабораторный работник заразился прионной болезнью через прокол кожи щипцами, используемыми для обработки срезов мозга животного, инфицированного адаптированной к овцам BSE^22,23. Такие сценарии передачи могут происходить в клинических, лабораторных и диагностических лабораториях, где обрабатываются образцы прионов.

Прионы устойчивы к распространенным методам дезинфекции и могут сохраняться и оставаться инфекционными на поверхностях в течение длительных периодов времени 24,25,26,27,28,29. Обычные методы дезинфекции, такие как использование этанола, фенольных очистителей, перекиси водорода, различных форм излучения и формальдегида, недостаточны для инактивации прионов, позволяя поверхностям сохранять инфекционность 30,31,32,33,34,35,36,37. Эти характеристики способствуют передаче прионов при ятрогенном и профессиональном воздействии.

Методы обнаружения прионов окружающей среды были разработаны лишь недавно. Метод мазка из окружающей среды в сочетании с конверсией, вызванной землетрясением в реальном времени (RT-QuIC), позволяет оценить остаточную прионную инфекционность с поверхностей окружающей среды, а также с обычных лабораторных поверхностей после неэффективной дезинфекции 38,39,40,41,42. В этой статье мы опишем, как этот метод может быть включен в более широкую программу безопасности прионов. В целом, этот метод может обеспечить мониторинг протоколов дезинфекции, зависящих от лаборатории, исследование и надлежащее документирование статуса загрязнения, что может помочь обеспечить достоверность экспериментов за счет минимизации перекрестного загрязнения, оценки мест общего пользования на предмет прионного загрязнения и позволяет проводить направленную переподготовку персонала на основе часто загрязненных территорий.

протокол

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены и соответствуют Руководству по уходу за лабораторными животными и их использованию Комитетом по уходу за животными и их использованию Университетом Крейтона.

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематический обзор лабораторного испытания на безопасность прионов показан на рисунке 1.

1. Выбор места взятия мазка и подготовка к взятию поверхностного мазка

1. Определите и пометьте соответствующие зоны наблюдения для взятия мазков. Обратитесь к предоставленному шаблону для получения документации и справочных материалов (рисунок 2 и дополнительный рисунок 1).
2. Подготовьте две микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл для каждой из выявленных областей. Добавьте 250 мкл фосфатно-солевого буфера Дульбекко в первый комплект микроцентрифужных пробирок для использования на этапе 3.2. Оставьте второй комплект микроцентрифужных пробирок пустым для использования на шаге 4.3.
3. Извлекайте тампоны с пенопластовыми наконечниками из хранилища в месте, свободном от прионных загрязнений.
4. Подготовьте выжимную бутылку с водой Milli-Q (MQ_{H 2}O) для использования на шаге 2.1.

2. Подготовка мазка с положительным и отрицательным контролем

1. Подготовьте разведения для положительного и отрицательного контроля мазка с использованием соответствующих типов контроля. Пример: Для положительного контроля приготовьте 1% разведение инфицированного прионом гомогената мозга в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS). Для отрицательного контроля готовят 0,1% разведение неинфицированного (UN) гомогената мозга (BH) из того же вида, что и положительный контроль при DPBS.
2. Надев чистые перчатки, достаньте нужное количество тампонов из чистой упаковки и поместите сторону ручки вниз в штатив для трубок, стараясь расставлять поролоновые тампоны так, чтобы кончики не соприкасались с другими тампонами или поверхностями. Для каждого контрольного образца подготовьте по три тампона. Меняйте перчатки между каждым образцом.
3. Держа за ручку чистый поролоновый тампон, нанесите 50 мкл соответствующих положительных и отрицательных контрольных образцов на наконечники поролонового тампона. Обязательно приложите кончик тампона с обеих сторон, чтобы обеспечить полное впитывание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда меняйте перчатки перед тем, как вынимать чистый тампон из штатива для пробирок.
4. С помощью ножниц отрежьте лишнюю ручку тампона (примерно на 1/2 длины) и поместите тампон в предварительно нагруженную микроцентрифужную пробирку поролоновой частью наконечника вниз. Убедитесь, что пенопластовый наконечник погружен в DPBS и что ручка надлежащим образом обрезана, чтобы полностью закрыть крышку микроцентрифужной пробирки.
5. Продолжайте наносить контрольные образцы после смены перчаток до тех пор, пока не будут нанесены все образцы.

3. Поверхностный тампон

1. Держа за ручку чистый тампон из пенопласта, предварительно смочите пенопластовый наконечник MQ_{H 2}O и стряхните излишки. Поместите смоченный пенопластовый кончик тампона на выбранную для наблюдения область и проведите по ней вперед и назад примерно десять раз, одновременно вращая кончиком тампона по поверхности.
2. С помощью ножниц отрежьте лишнюю ручку тампона (примерно на 1/2 длины) и поместите тампон в предварительно нагруженную микроцентрифужную пробирку поролоновой частью наконечника вниз. Убедитесь, что пенопластовый наконечник погружен в DPBS и что ручка надлежащим образом обрезана, чтобы полностью закрыть крышку микроцентрифужной пробирки.
3. Выбросьте перчатки и наденьте новые перчатки перед каждым соответствующим местом взятия мазка, чтобы свести к минимуму вероятность перекрестного загрязнения.
4. Повторяйте процедуру до тех пор, пока не будут взяты мазки на все участки, выбранные для наблюдения.

4. Экстракция тампона и концентрирование в вакууме

ПРИМЕЧАНИЕ: Включите вакуумный концентратор за 30 минут до использования, чтобы инструмент нагрелся.

1. Поместите микроцентрифужные пробирки в круглую решетку для пробирок. Поместите штатив для микрофуг-пробирок в водяную баню с чашечкой-рупором. Убедитесь, что тампоны из пенопласта в DPBS в микроцентрифужных пробирках находятся ниже поверхности воды в рожке чашки (часть ручки не обязательно погружать в воду). Примените следующие настройки: общее время работы 15 с (5 с вкл., 5 с выкл.) при мощности ~75-85 Вт.
2. После ультразвуковой обработки пробирки центрифугируют в течение примерно 15 с, чтобы собрать DPBS на дне пробирки перед перекачкой.
3. С помощью пипетки P1000 объемом 250 мкл тщательно соберите всю жидкость (экстракт тампона) со дна микроцентрифужной пробирки и перенесите в соответствующую микроцентрифужную пробирку из второго, пустого набора с предварительной маркировкой. С помощью наконечника пипетки выдавите лишнюю жидкость из поролонового наконечника. Выбросьте пустые пробирки с тампонами.
4. Установите следующие настройки на вакуумном концентраторе: Температура: 45 °C, Время нагрева: 15 мин, Время работы: 2 ч, Вакуум: 5,1.
5. Поместите микроцентрифужные пробирки, содержащие экстракты тампонов, в вакуумный концентратор, убедившись, что пробирки сбалансированы и все крышки пробирок открыты.
6. По завершении цикла убедитесь, что образцы полностью концентрированы (остается только гранула). Храните гранулы при температуре -80 °C до использования для RT-QuIC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях для обеспечения полной концентрации может потребоваться дополнительное время концентрации вакуума. Удалите все концентрированные пробы, оставив только пробирки, в которых еще содержится жидкость. Восстановите баланс оставшихся пробирок в концентраторе и запускайте с шагом в 1 час до полного концентрирования образцов.

5. Подготовка контрольных элементов для использования в RT-QuIC

ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль RT-QuIC должен быть выполнен до анализа экстрактов мазков из окружающей среды, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения во время процедур взятия, экстракции или концентрирования. Примеры макетов см. на рисунках 3 и 4.

1. Приготовьте соответствующий контрольный препарат с отрицательным результатом теста RT-QuIC (например, гомогенат неинфицированного мозга [UN BH]) путем разбавления до соответствующей концентрации в растворе для разведения тканей (N2-0,1% SDS/PBS). Приготовьте положительное контролируемое разведение с помощью вакцинированного прионом гомогената мозга до разведения ^10-3 в растворе для разведения тканей.
2. Извлеките ранее хранившиеся гранулы экстракта контрольного тампона с температуры -80 °C и повторно суспендируйте каждую с 50 мкл MQ H₂O путем пипетирования вверх и вниз примерно 10 раз с последующим кратковременным вортексом. Дайте образцам постоять при комнатной температуре (RT) во время выполнения остальных шагов.
3. Загрузите 2 мкл указанных пластин контрольной группы, включая контрольную пластину с отрицательной пластиной (только раствор разведения тканей и гомогенат неинфицированного мозга) и контрольную группу с положительной пластиной (гомогенат инфицированного мозга).
4. Загрузите по 2 мкл каждой положительной и отрицательной реплики экстракта тампона как минимум в четыре лунки с пластинами RT-QuIC для репликации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если отрицательные результаты анализа мазка показывают посев RT-QuIC выше лабораторного стандарта для положительного определения, это будет указывать на то, что загрязнение было внесено в процессе взятия мазка, экстракции и концентрирования, и что эксперимент по взятию мазка должен быть проведен снова

6. Подготовка образцов для использования в RT-QuIC

1. Приготовьте соответствующий отрицательный контрольный лист (например, неинфицированный гомогенат мозга, неинфицированный лимфатический узел и т.д.) путем разведения до соответствующей концентрации в растворе для разведения тканей (N2-0,1% SDS/PBS). Приготовьте положительный контрольный контроль, разбавив инфицированный гомогенат мозга до разведения ^10-3 в растворе для разведения тканей.
2. Удалите ранее хранившиеся гранулы экстракта тампона с температуры -80 °C и повторно суспендируйте 20-50 мкл раствора для разведения тканей (в зависимости от предполагаемой степени загрязнения) путем пипетирования вверх и вниз примерно десять раз с последующим кратковременным вортексом. Дайте образцам постоять в режиме RT во время выполнения остальных шагов.
3. Загрузите 2 мкл указанных контрольных пластин, включая контрольные пластины с отрицательными пластинами (только раствор разведения тканей и гомогенат неинфицированного мозга) и контрольный с положительным планшетом (гомогенат инфицированного мозга) в лунки планшетов RT-QuIC.
4. Загрузите по 2 мкл каждого экстракта тампона в четыре повторяющиеся лунки.

7. Анализ и результаты ОТ-QuIC

1. Выполнение ОТ-QuIC согласно индивидуальным лабораторным протоколам (опциональные протоколы^38,40).
2. Определите параметры, необходимые для определения положительности образца (см. репрезентативные результаты, рисунок 5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры определяются каждой лабораторией.
3. Запишите результаты в предоставленную таблицу и примите соответствующие меры на основе передовых лабораторных практик (Таблица 1 и дополнительный рисунок 2).

Результаты

Письменное описание положительных и отрицательных результатов (включая контроль положительных/отрицательных результатов с помощью планшетов и мазков)

Мазки с отрицательным контролем включаются в контрольный мазок для мониторинга потенциального прионного загрязнения, которое может быть внесено в процессе взятия мазка, экстракции и концентрирования. Первый планшет RT-QuIC, выполненный для данного ежемесячного наблюдения, должен включать положительный и отрицательный контрольные мазки. Успешный отрицательный контроль не может преодолеть порог положительной флуоресценции (рис. 6А). Этот результат указывает на то, что загрязнение не было внесено во время экспериментальных процедур. Успешные экстракты положительных контрольных мазков демонстрировали положительный посев во всех репликационных лунках для данного образца (положительные контрольные мазки были загрязнены адаптированным к хомяку трансмиссивным штаммом норковой энцефалопатии Hyper (HY TME) мозга. Включение положительного контрольного ряда разведения позволяет определить чувствительность обнаружения прионов для данного эксперимента (рис. 6A).

При исследовании образцов экстракта поверхностного тампона поверхности, на которых не наблюдается посева выше заданного положительного порога флуоресценции, можно считать прионноотрицательными (рис. 6B). И наоборот, экстракты поверхностных тампонов, загрязненных прионами, будут демонстрировать способность к посеву выше положительного порога флуоресценции, хотя отношение максимальных точек (MPR) и время флуоресценции могут варьироваться по сравнению с включенным контролем положительной пластины (рис. 6B). Способность метода оценивать адекватную дезинфекцию подчеркивается обработанными отбеливателем прионами, загрязненными поверхностями, которые теперь не засеивают RT-QuIC (рис. 6B).

Важно отметить, что в то время как наша лаборатория определяет положительный образец как образец, который превышает установленный порог положительной флуоресценции по крайней мере в половине повторяющихся лунок, необходимо, чтобы каждая лаборатория устанавливала свои собственные стандарты. Скорость образования амилоида (RAF) и время до флуоресценции также могут быть использованы для установления лабораторных пороговых значений положительного результата.

Мы наблюдали результаты поверхностных артефактов, которые превышают положительный порог флуоресценции, но с измененными кинетическими кривыми и после аномально длительного времени флуоресценции по сравнению с положительными контрольными образцами (рис. 6C). Эти результаты следует интерпретировать с осторожностью, так как они могут быть вызваны присутствием пыли или остаточных химических веществ, присутствующих на поверхности. Эти результаты подчеркивают необходимость общей лабораторной чистоты, а также критерии для дифференциации истинноположительного и ложноположительного посева.

Утилизация твердых и жидких биологически опасных отходов должна осуществляться в соответствии с действующими руководящими принципами конкретного учреждения по утилизации биологически опасных отходов. Распространенные методы прионной дезинфекции включают обработку гидроксидом натрия, гипохлоритом натрия (отбеливателем) или автоклавирование при 134 °C в течение 18 минут 43,44,45,46.

Рисунок 1: Схематический обзор лабораторного теста на безопасность прионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Пример макета сайта для взятия мазков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: План эксперимента с образцами для контроля мазков включал лабораторный тест на безопасность прионов. (A) Схема образца для контроля экстракта мазка с отрицательным и положительным результатом. (B) Отрицательный и положительный контроль экстракта мазка должен быть повторно суспендирован 50 мкл_Н2О. 10-кратное разведение экстракта ресуспендированного тампона должно быть получено путем разведения его в растворе для разведения тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Схема эксперимента с образцом для экстрактов поверхностных мазков из лабораторного теста на безопасность прионов. (A) Схема образца для экстрактов поверхностных мазков. (B) Образцы экстракта поверхностного тампона должны быть повторно суспендированы 20 мкл раствора для разведения тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Ежемесячный лабораторный тест безопасности прионов. Блок-схема используется для интерпретации результатов и определения соответствующего ответа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

(A) Контрольная пластина поверхностного тампона, содержащая отрицательный контроль экстракта тампона в трех (DPBS, гомогенат мозга неинфицированного хомяка ^10-4 и ^10-10) и положительный контроль экстракта тампона в тройном (гомогенат мозга HY ^10-3). (B) Репрезентативные экстракты тампонов для настольных поверхностей, поверхностей из стекла и нержавеющей стали (S.S.), которые были проверены до загрязнения, после загрязнения HY ^10-3 и после обработки загрязненных поверхностей отбеливателем. (C) Флуоресцентное отслеживание сравнения неинфицированного гомогената мозга ^10-4, гомогената HY мозга ^10-3 и экстракта тампона со столешницы, покрытого тонкой пленкой пыли. Отрицательные пластины контроля для панелей А и В включают заготовку (раствор для разведения тканей) и неинфицированный гомогенат мозга хомяка ^10-4. Панель В включает добавление неинфицированного гомогената мозга ^10-4 и положительный контроль гомогената мозга HY ^10-3. Порог положительной флуоресценции (проиллюстрированный красной пунктирной линией) был определен равным 2. Сообщаемое отношение максимальных точек (MPR) представляет собой максимальную флуоресценцию, деленную на начальные показания флуоресценции, полученные считывателем планшетов. Каждая точка представляет собой одну репликацию технической скважины для данного типа пробы. Представлены среднее значение и стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Образец образца сайта мазка с ежемесячной документацией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный рисунок 1: Шаблон макета сайта с помощью свабинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Ежемесячная документация по месту взятия мазка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Описанный метод безопасного мазка прионов может быть использован для усиления существующих мер безопасности прионов. Этот метод позволяет контролировать прионные лабораторные помещения и оборудование, а также общие лабораторные помещения на предмет потенциального загрязнения прионов. Важно отметить, что этот метод может быть адаптирован для тестирования специальных лабораторных методов дезинфекции для проверки обеззараживания загрязненных прионами поверхностей. Поскольку различные прионные штаммы демонстрируют различную чувствительность к методам дезинфекции, этот метод может подтвердить, что эти методы эффективны для текущих лабораторных экспериментов, таких как обработка гидроксидом натрия или гипохлоритом натрия (отбеливателем)^43,44.

Ключевыми шагами для этой методологии являются определение подходящих участков взятия мазков, которые обеспечат выборку как районов с интенсивным движением, так и зон для мониторинга, которые могут быть вовлечены в последующее перекрестное загрязнение экспериментов. Кроме того, лаборатории должны использовать положительный и отрицательный контроль, который точно отражает тот, который обычно используется в данной лаборатории или клинике. Например, при работе с прионами грызунов, положительный и отрицательный контроль должны соответствовать этому виду. Наконец, данные эпиднадзора должны поддерживаться в актуальном состоянии и быть организованы таким образом, чтобы можно было легко определить тенденции положительного результата, что позволит смягчить последствия и переобучить персонал лаборатории в случае стабильно положительных результатов в данной области.

Одним из ограничений этого протокола является потенциальная генерация ошибочных результатов RT-QuIC. Учитывая чувствительную природу RT-QuIC, присутствие остатков моющих средств, соли и других веществ на лабораторных поверхностях может повлиять на^{исход реакции}. В целом, учитывая это наблюдение, полезно, чтобы поверхности оставались свободными от веществ, которые могут мешать RT-QuIC, таких как остаточная соль, моющие средства и пыль. Мы ожидаем, что по мере того, как будут доступны усовершенствования методологии RT-QuIC, многие из текущих ограничений RT-QuIC будут устранены. Поэтому мы призываем конечного пользователя быть в курсе литературы, чтобы воспользоваться последними улучшениями RT-QuIC.

Ключевым преимуществом этого метода для лабораторий, исследующих прионы, является возможность свести к минимуму загрязнение, которое может повлиять на результаты чувствительных анализов амплификации. Инструменты для вскрытия обычно дезинфицируются перед повторным использованием для будущих вскрытий. Описанный метод взятия мазков обеспечивает метод оценки инструментов вскрытия на остаточную прионную инфекционность, которая может повлиять на последующие результаты. Это может обеспечить дополнительный уровень строгости экспериментов, чтобы исключить возможность того, что обнаружение прионов в тканях не было связано с загрязнением инструментами для вскрытия.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fisherbrand PurSwab Foam Swabs	Fisher brand	Catalog #14-960-3E
Milli-Q IQ 7005 Ultrapure Water System	MilliporeSigma	Q7005T0C
Mini-centrifuge, 6000 rpm	Southern Labware	MLX-306
Omega plate reader	BMG Labtech	FLUOstar Omega plate reader
Q700 sonicator	QSonica	Q700-110
Recombinant hamster prion protein	MNPRO	MNPROtein-Hamster	syrian hamster, amino acids 90-231
Savant speedvac	Thermo Scientific	SPD1030-230
Silica nanospheres (50 nm)	nano Composix	SISN50-25M