Addition of Primary and Secondary Antibodies to the Transfected HeLa Cells to Monitor the mtDNA Distribution

Чтобы начать добавление первичного антитела, аспирируйте бычий сывороточный альбумин или BSA из фиксированных и заблокированных трансфицированных клеток HeLa, оставляя 10 микролитров раствора BSA в лунке. Затем добавьте 10 микролитров раствора первичного антитела, приготовленного в 3% BSA в PBS, и инкубируйте планшет в темноте при четырех градусах Цельсия в течение ночи. После инкубации промыть каждую лунку четыре раза 100 микролитрами PBS, оставив 10 микролитров после последней стирки.

Затем добавьте 10 микролитров раствора вторичных антител в 384-луночную пластину. Используйте изотип-специфические антитела, конъюгированные с флуорохромами, такие как Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 555. После инкубации пластины в темноте в течение одного часа промойте каждую лунку четыре раза 100 микролитрами PBS и оставьте 50 микролитров PBS в лунке после последней стирки.

Использование анти-ДНК-антител позволило контролировать распределение митохондриальной ДНК в клетке в данных экспериментальных условиях. Подавление митохондриального транскрипционного фактора A TFAM привело к резким изменениям в распределении митохондриальной ДНК с меньшим количеством митохондриальных пятен ДНК, чем в контрольных клетках. Количественная оценка среднего флуоресцентного сигнала от антитела против ДНК показала увеличение в несколько раз при подавлении TFAM по сравнению с другими тестируемыми условиями.