Подготовьте машину для замораживания под высоким давлением или HPF не менее чем за два часа до начала эксперимента в соответствии с инструкциями производителя. Перенесите алюминиевые носители HPF типа A в двухмиллиметровую центрифужную пробирку, содержащую один миллилитр этанола, и обработайте их ультразвуком в ультразвуковом очистителе в течение 10 минут. Высушите носители в чашке Петри, покрытой качественной фильтровальной бумагой.
Предварительно очищенные носители замочите в 1-гексадецене. Используйте тонкий пинцет, чтобы взять заранее подготовленный сапфировый диск из чашки для культивирования клеток HeLa. Прикоснитесь к маркированной поверхности качественной фильтровальной бумагой, чтобы удалить лишнюю среду.
Установите сапфировый диск в держатель образца HPF и быстро закройте диск алюминиевым носителем глубиной 0,025 миллиметра, содержащим 1-гексадецен. Аспирируйте излишки раствора качественной фильтровальной бумагой. Загрузите держатель образца для замораживания под высоким давлением.
Выгрузите сапфировый дискодержатель в сборе под жидким азотом в пенопластовый криобокс. Приготовьте два миллилитра замораживающей фиксации или раствора ФСФ один в 20-миллиметровом круглом полипропиленовом контейнере в вытяжном шкафу и заморозьте его с помощью жидкого азота. С помощью пинцета с предварительно охлажденным нагрузкой сапфировых дисков и несущих узлов загрузите контейнер с замороженным раствором ФСФ под жидким азотом.
Переместите этот контейнер в предварительно охлажденную камеру автоматической машины для замены замораживания для обработки FSF при температуре минус 90 градусов по Цельсию. Держите образцы при температуре минус 90 градусов Цельсия в течение одного часа, затем отделите сапфировые диски от носителей предварительно охлажденным пинцетом, убедившись, что отмеченные стороны сапфировых дисков обращены вниз. Держите образцы при температуре минус 90 градусов по Цельсию еще от 8 до 10 часов, а затем прогрейте до минус 60 градусов по Цельсию в течение трех часов.
Замените раствор ФСФ в контейнере предварительно охлажденным ацетоном и выдерживайте при температуре минус 60 градусов Цельсия в течение одного часа. Повторите эту стирку ацетоном дважды. Прогреть до минус 30 градусов по Цельсию в течение трех часов.
Тем временем приготовьте и предварительно охладите два миллилитра раствора FSF два в двухмиллилитровой центрифужной пробирке при температуре минус 30 градусов по Цельсию. Замените ацетон вторым раствором FSF и выдерживайте при температуре минус 30 градусов Цельсия в течение трех часов. Затем замените два раствора ФСФ в емкости предварительно охлажденным ацетоном и выдерживайте 30 минут при температуре минус 30 градусов Цельсия.
Повторите эту стирку ацетоном дважды. Прогревается от минус 30 до 4 градусов по Цельсию в течение двух часов. Замените ацетон двумя миллилитрами 0,2-молярного буфера HEPES.
Смените буфер один раз и инкубируйте при комнатной температуре или четырех градусах Цельсия в течение ночи.
