Для начала возьмите колбу с культивируемыми клетками фибробластов, покройте 10-сантиметровую пластину для культивирования клеток, подходящую для культивирования hiPSC, четырьмя миллилитрами раствора холодного покрытия на пластину и инкубируйте пластину в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. После этого удалите среду из фибробластов и промойте их четырьмя миллилитрами предварительно разогретого PBS на колбу. Аспирируйте PBS и свяжите фибробласты с четырьмя миллилитрами трипсина-ЭДТА на колбу, инкубируя в течение пяти-семи минут при 37 градусах Цельсия.
Контролируйте отслоение клеток с помощью фазово-контрастного микроскопа и, при необходимости, постучите по стенке колбы, чтобы отделить клетки от пластиковой поверхности. Переложите отделившиеся клетки в коническую трубку объемом 50 миллилитров и промойте пустые колбы шестью миллилитрами предварительно разогретой среды фибробластов. Соберите и объедините оставшиеся ячейки в коническую трубку.
Затем центрифугируют клетки при 200 г в течение пяти минут при 20 градусах Цельсия. Аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы клетки в трех миллилитрах свежего, предварительно подогретого PBS. Пересчитайте клетки, перенесите 1,5 раза по 10 на шестой фибробласты в новую коническую трубку и заполните PBS до пятимиллиметровой отметки.
Центрифугируйте пробирку на 200 г в течение пяти минут при температуре 20 градусов Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу ячейки в пяти миллилитрах электропорационной среды и снова центрифугу. Тем временем аспирируйте раствор покрытия из покрытой 10-сантиметровой пластины для культивирования клеток и добавьте семь миллилитров предварительно разогретой среды фибробластов.
По окончании центрифугирования откажитесь от надосадочной жидкости и повторно суспендируйте гранулу ячейки в электропорационной среде с концентрацией 1,5 раза по 10 к шестой ячейке в 250 микрол. Перенесите суспензию ячейки объемом 250 микролитров в кювету для электропорации с зазором в четыре миллиметра. Затем готовят смесь для трансфекции плазмы, добавляя четыре микрограмма каждой плазмиды к общему объему 50 микролитров электропорационной среды.
Перенесите смесь для трансфекции в кювету, аккуратно перемешайте щелчком и электропорируйте одним импульсом при напряжении 280 вольт. Наконец, перенесите 150 микролитров электропорированных фибробластов на подготовленную 10-сантиметровую пластину для культивирования клеток. Трижды перемешайте тарелку во всех направлениях, чтобы распределить ячейки, и инкубируйте в течение ночи.
Фибробласты представлены в длинном веретенообразном фенотипе размером от 150 до 300 нанометров. После перепрограммирования появляются колонии с 50-микрометровыми маленькими ИПСК с четкими границами. ИПСК отличаются высоким соотношением ядер к телу и повышенной скоростью пролиферации.
