Введение небольших внеклеточных везикул человека, полученных из плаценты, мышам для изучения разрушения ГЭБ

Для выполнения небольших внеклеточных везикул или инъекций СЭВ мышам используют СЭВ, выделенные из эксплантов плаценты человека, культивируемые в гипоксических и нормоксических условиях. Разбавьте 200 мкг плацентарных SEV в фосфатном буфере при pH 7,4 до конечного объема 70 микролитров. Перед инъекцией оцените самочувствие животного по шкале RMCBS.

Затем с помощью инсулинового шприца с иглой 30-го калибра вводят раствор в наружную яремную вену должным образом обезболиваемой мыши. После инъекции слегка надавите на область инъекции в течение 15 секунд сухим ватным тампоном. Оцените самочувствие мышей по шкале RMCBS через три, шесть, 12 и 24 часа после инъекции.

Для анализа экстравазации синего Эванса приготовьте 2%-ный раствор синего красителя Эванса в PBS. Через 24 часа после введения SEV с использованием ретроорбитального доступа введите синий раствор Эванса мыши, находящейся под должным образом анестезией. После того, как синий Эванс циркулирует в организме животного, выполните внутрисердечную перфузию на мыши под наркозом примерно тремя миллилитрами физиологического раствора, чтобы удалить краситель из кровообращения.

Зафиксировав мышь интракардиальной инфузией 4%-ного параформальдегида в BBS и осторожно извлекя мозг, взвесьте и сфотографируйте его. Следуя продемонстрированной процедуре, извлеките мозг у животных в каждой группе. С помощью стереоскопа с зумом визуализируйте изображения рассеченных срезов мозга.

Используйте полученные изображения для количественной оценки экстравазации синего цвета Эванса с помощью программного обеспечения ImageJ. В отличие от мышей, которым вводили SEV из нормоксической плаценты, мыши, которым вводили SEV из гипоксической плаценты, показали прогрессирующее снижение неврологического показателя в течение 24 часов после инъекции. Мозг мышей, которым вводили SEV из гипоксической плаценты, имел более высокую экстравазацию синего Эванса, чем мозг животных, которым вводили SEV из нормоксической плаценты.

В мозге мышей, которым вводили SEV из гипоксической плаценты, наблюдалось снижение количества белка CLDN5, который имеет решающее значение для плотности гематоэнцефалического барьера. Все эти результаты указывали на нарушение гематоэнцефалического барьера, привнесенного СЭВ из гипоксической плаценты.