Визуализация гибридов ДНК с использованием хемилюминесценции для обнаружения лептоспир в пробах воды

Для начала перенесите амплифицированные ПЦР образцы на нейлоновую мембрану и гибридизируйте их с зондом. Дважды промойте мембрану двухкратным SSPE, смешанным с 0,1% SDS при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем инкубируют мембрану с пятикратным SSPE, смешанным с 0,1%SDS, на зондах при температуре отжига в течение 15 минут.

В конце инкубации промывают мембрану буфером один и два в течение пяти и 30 минут соответственно. После однократного промывания мембраны буфером добавьте 15 микролитров антител против дигоксигенина и инкубируйте в течение 45 минут. Дважды промойте мембрану в буферной камере при комнатной температуре в течение 15 минут.

Постирайте один раз в буфере три при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем добавьте CSPD, готовый к использованию, и оставьте на пять минут. После этого поместите мембрану в прозрачный полиэтиленовый пакет и выдержите мембрану на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

После этого просушите полиэтиленовый пакет, и закрепите его скотчем на уже использованной рентгенографической пластине. Для обнаружения осторожно поместите неподвижную мембрану лицом к новой рентгенографической пластине в темноте и вставьте ее в рентгенографическую кассету. Зарегистрируйте время воздействия.

Точка A7 показывает, что лептоспиральная ДНК присутствовала на поверхности пруда три. Сигнал зондов может быть легко обнаружен с точностью до 3,91 умножить на 10 до отрицательных первых нанограммов смеси ДНК лептоспиры.