Для начала приготовьте одномиллилитровый шприц, прикрепленный к игле 25-го калибра лезвием вверх. Гепаринизируйте шприц, набрав 200 микролитров неразбавленного раствора гепарина натрия и потянув его вверх и вниз несколько раз. Затем вытолкните раствор гепарина из шприца.
Подготовьте впитывающие ватные и спиртовые тампоны. Также включите регулируемую лампу, чтобы осветить участок, куда будет помещен мартышка для забора крови. Подготовьте удерживающее устройство.
Затем откройте удерживающую часть с помощью губчатого ремня. Вставив мартышку в удерживающее устройство, удерживайте и продвигайте ее в цилиндрическую часть. Чтобы закрепить его, прижмите губчатый ремень.
Положите ногу, с которой будет собираться кровь, поверх другой. Держите ноги недоминирующей рукой, поместив средний и безымянный пальцы внутрь каждой ноги, чтобы закрепить их, а другие пальцы снаружи каждой ноги, чтобы зафиксировать их. Проверьте, видна ли бедренная вена у основания бедра.
Если нет, пальпируйте пульсирующую артерию и используйте ее в качестве ориентира, чтобы проверить, проходит ли вена внутри нее. Продезинфицируйте место прокола с помощью спиртового тампона. Вставьте лезвие иглы стороной вверх под углом от 15 до 20 градусов.
Стабилизируйте руку, положив ее на другую руку, чтобы предотвратить выскальзывание иглы из кровеносного сосуда во время сбора. Осторожно оттяните поршень назад, чтобы оказать отрицательное давление. Вытолкните кончик иглы вперед.
Как только кровь попадет в шприц, сохраняйте положение кончика иглы до тех пор, пока не будет собран необходимый объем. Осторожно вытащите иглу, слегка надавливая на место прокола с помощью мизинца. Затем с помощью впитывающего ватного тампона сразу же надавите на место прокола на три минуты, чтобы остановить кровотечение.
Переверните шприц, чтобы смешать кровь и гепарин. После того как кровотечение остановится, снимите губчатый ремень. Держите животное за талию одной рукой и поворачивайте животное, чтобы держать его подмышкой сзади другой рукой.
Верните мартышку в клетку и обеспечьте ее любимой едой. Время от времени проверяйте возникновение гематомы. Далее отсоедините иглу от шприца, чтобы предотвратить гемолиз.
Затем медленно вытолкните собранную кровь по внутренней стороне стенки 1,5-миллилитровой микротрубки. Центрифугируйте пробирку при температуре 1, 100г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую отделенную плазму, в новую пробирку, осторожно избегая попадания клеток крови.
Измерьте уровень прогестерона и эстрадиола с помощью набора ИФА или автоматического анализатора. Используя этот протокол, уровни прогестерона и эстрадиола контролировались у трехлетней самки мартышки в течение более 38 дней. Начальная лютеиновая фаза показала высокий и стабильный уровень Р4, резко снизившийся на 12-й день, сигнализируя о начале фолликулярной фазы.
Этот переход также ознаменовался снижением уровней Е2. Во время фолликулярной фазы уровень Р4 был постоянно низким с небольшим повышением к концу, в то время как уровень Е2 резко достигал пика, а затем снижался, что указывало на возможную овуляцию. Лютеиновая фаза демонстрировала высокий уровень Р4 до тех пор, пока резкое снижение не ознаменовало переход от лютеиновой к фолликулярной фазе, сопровождавшийся снижением уровня Е2.
Дополнительные исследования на мартышках выявили среднюю продолжительность фолликулярной и лютеиновой фаз, что помогло определить типичную продолжительность гормонального цикла. Гормональные изменения вокруг овуляции включают повышение уровня CG, снижение уровня E2 и повышение уровня P4. Повышение уровня КГ происходит до овуляции, что позволяет предположить, что КГ может служить предиктором приближающейся овуляции.
Напротив, снижение уровня Е2 происходит после овуляции, что делает его наиболее многообещающим маркером для подтверждения того, что овуляция произошла.
