Для начала приготовьте буфер для промывки, добавив сбалансированный солевой раствор Хэнка буфером с 10 миллимолярными кучами. Храните буфер при температуре четыре градуса Цельсия до использования. Приготовьте среду пигментного эпителия сетчатки или РПЭ в DMEM и подогрейте до 37 градусов Цельсия на водяной бане.
Положите усыпленную мышь на бок глазом вверх. Поместите указательный палец над глазом, а большой — под ним. Слегка надавите на костную структуру вокруг глаза, чтобы глазное яблоко выступило.
Вставьте кончик слегка открытых ножниц под глаз и осторожно поверните запястье от глаза на 90 градусов, пока глаз не отсоединится от глазницы. Немедленно поместите и обваляйте глаз в 70% этаноле в течение пяти секунд. Затем переложите глаз в буфер для промывки, хранящийся на льду.
Под препарирующим микроскопом поместите глаз в чашку Петри, наполненную буфером для промывки и полосками смоченной марли. Стабилизируйте глаз, удерживая зрительный нерв пинцетом и с помощью хирургического ножа аккуратно сделайте разрез на уровне Ora Serrata. Вставьте ножницы Vannas в разрез и разрежьте по окружности Ora Serrata до тех пор, пока не будут удалены передний сегмент и стекловидное тело.
Аккуратно отсоедините сетчатку от наглазника с помощью привязанных щипцов, не повреждая слой РПЭ. С помощью ножниц удалите зрительный нерв и излишки соединительной ткани из наглазника, не прокалывая наглазник. Перенесите наглазник в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую один миллилитр 0,25% трипсина и 0,02% ЭДТА.
Выдержите наглазник на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. Каждые две минуты извлекайте трубку и 40 раз сильно постучите дном по столешнице. После инкубации с помощью пипетки AP-1000 осторожно перемешайте вверх и вниз три раза, чтобы нарушить работу наглазника.
Чтобы нейтрализовать трипсин, немедленно нанесите слой отделенных листов РПЭ, исключая наглазник, на 0,5 миллилитра FBS в конической трубке объемом 15 миллилитров. Затем по каплям добавьте среду RPE на слои листов FBS и RPE, чтобы разбавить трипсин. Центрифугируйте СИЗД при 340G в течение трех минут.
Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в подходящем количестве среды RPE для 24-луночного планшета. Инкубируйте RPE при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение трех дней. Через 24 часа после выделения РПЭ пигментные клетки ядра начинают оседать без полного прилипания.
В течение 48-72 часов эти клетки прикрепляются и распространяются, сохраняя темную пигментацию в прозрачном ядре. Через пять дней клетки RPE демонстрируют повышенную беглость в начале формирования межклеточных контактов, превращаясь в поляризованный монослой с гексагональными структурами. Изолированные РПЭ показали чистоту, о чем свидетельствует специфический маркер РПЭ и целостность плотных соединений после шести дней в культуре.
