Эта двух сосудная окклюзионная мышь модели церебральной ишемии-реперфузии может исследовать патофизиологию инсульта. Эта модель будет вызывать стабильный инфаркт объем массы мозга проникающих иммунных клеток в ишемическом мозге и поведенческий дефицит после ишемии головного мозга-реперфузии. В этой модели, инфаркт вызывается в корковых областях и уровень смертности является низким.
Поскольку лигация MCAO reperfusion модель требует краниотомии подвергать размер дистального MCA, размер может быть легко подтверждена, и экзамен ли кровоток в дистальной MCAO нарушается во время процедуры является простым. Предоставьте мышам свободный доступ к воде и пище до операции. Автоклав хирургических инструментов, и использовать 70% этанола для дезинфекции хирургического стола и оборудования.
После анестезии от восьми до 12 недель мыши, убедитесь, что он не имеет педаль рефлекс при тестировании с помощью твердой щепотку ноги. Используйте ветеринарную мазь, чтобы предотвратить сухость глаз, пока мышь находится под наркозом. Чтобы контролировать кровяное давление, сначала удалить волосы, а затем использовать неинвазивную систему кровяного давления и физиологическую систему мониторинга для мониторинга температуры прямой кишки и артериальных газов крови.
Вводите мышь подкожно с помощью профилактического антибиотика. Затем поместите мышь в положение лежа на грелке. Чтобы разоблачить кожу, используйте электрические клиперы для бритья меха на брюшной области шеи и в области между правым глазом и правым ухом.
Очисти мех от тела животного эпилятивным кремом и продезинфицировать хирургическое отделение 70%этанолом. Затем вырезать один сантиметр длиной средней линии разреза на шее с помощью ножниц радужной оболочки глаза. С типсами радужной оболочки, тщательно вскрыть общую сонную артерию, свободную от блуждающих нервов, не вызывая физической травмы, и использовать 5-0 шелковых швов, чтобы изолировать артерию.
Затем используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы сделать 0,3-сантиметровый разрез в коже головы в середине между правым глазом и правым ухом. Используя микро-ножницы, вырезать височной мышцы подвергать zygomatic и плоской кости. Поместите мышь под стерео рассечение микроскопа, и использовать микро дрель для создания двух миллилитров отверстие непосредственно над правой стороны дистальной средней мозговой артерии.
Используйте 10-0 шва для ligate ствол правой стороны дистальной MCA, и использовать нетравматический клип аневризмы, чтобы окклюдить правой стороне CCA. После желаемой продолжительности ишемии, удалить швы и аневризмы клип для восстановления притока крови к MCA и CCA. Используйте зажим шва для того чтобы загерметизировать разрез кожи на головке и загерметизировать цервикальные разрезы кожи с хирургическим клеем.
Впрыснуть бупренорфин подкожно для облегчения боли. Поддерживайте температуру тела животного при температуре 36,5 плюс-минус 0,5 градуса по Цельсию на грелке и не оставляйте без присмотра и не возвращайте его в компанию других животных до полного выздоровления от наркоза. Наконец, поместите мышь в клетку автоклава, чтобы она можно была свободно получить доступ к воде и пище после того, как она полностью восстановилась.
Используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы сделать разрез в коже головы обезболивающей и обезглавленной мыши, чтобы разоблачить череп. Затем используйте операционные ножницы, чтобы вырезать переднюю часть лобной кости, и ножницами радужной оболочки глаза, вырезать череп вдоль sagittal шва. С костной rongeur, отодвинуть лобной и теменной кости, и разоблачить мозг.
Удалите мозг и поместите его в матрицу мозга мыши. Используйте лезвия бритвы, чтобы получить двухми миллилитровые коронные ломтики, и поместите их в 50-миллилитровые трубки, заполненные пятью миллилитров 2%TTC. При использовании матрицы мозга мыши для получения корональных ломтиков, размер резки должен быть одинаковым в разных мозгах.
Размер резки влияет на размер ломтиков мозга, которые также влияют на расчет размера инфаркта. Пятно ломтиками мозга с 2%TTC и 1X PBS в течение 10 минут при 37 градусах по Цельсию, а затем промыть два раза с 10%формалин. Исправить ломтики мозга в 10%формалин при комнатной температуре в течение 24 часов.
После высыхания ломтики мозга на бумаге ткани поглощают избыток формалина, устраивают их на чистую пластиковую горку, ориентируя их от рострала к каудалу, и покрывают другой чистой пластиковой горкой. Сканирование слайда с помощью сканера. Переверните слайд и сканируйте обратную сторону.
Используйте программное обеспечение ImageJ для расчета области инфаркта каждого раздела, сначала открыв файл изображения и установив шкалу для изображения. Затем используйте выбор от руки, чтобы выбрать область инфаркта, и использовать регионы, представляющие интерес ROI менеджера для измерения области интересов. Наконец, суммировать области инфаркта для каждого раздела и умножить результат на толщину раздела, чтобы оценить общий объем инфаркта, а затем завершить статистический анализ, описанный в рукописи.
Увеличение продолжительности ишемии во время этой процедуры реперфузии MCAO вызвало различные степени ишемии индуцированного объема инфокта и потери нейронов в коре головного мозга правой области MCA. Кроме того, ишемия снизила активность локомоторного животного через 48 часов после повторного перепрофили MCAO. После ишемии головного мозга, реперфузии, основная часть периферических иммунных клеток проникли в ипсилатеральное полушарие ишемического мозга.
Кроме того, когда эту двухцелеувную модель окклюзии сравнивали с моделью MCAO, их объемы не отличались существенно. Микросверло должно быть тщательно использовано при создании отверстия в черепе. При неуместных действиях, легко вызывая кровотечение из MCA.
MCA не должны быть повреждены, и кровотечение следует избегать до и после перевязки процедуры. Окклюзия MCA и состояние reperfusion могут быть проверены лазерным Доплером. Этот метод может подтвердить состояние кровотока MCA.
