Связанные с опухолью макрофаги играют важную роль в микрооквидеоне опухоли. Понять, как различные генетические мутации в опухолевых клетках влияют на набор макрофагов, имеет решающее значение для разработки персонализированного лечения онкологических больных. Этот анализ обеспечивает простой и надежный способ оценки взаимодействия между опухолевыми клетками и макрофагами in vitro.
Этот анализ может быть изменен для оценки взаимодействия между опухолевыми клетками и другими иммунными клетками in vitro. Чтобы начать эту процедуру, разогреть без сыворотки стволовых клеток среды, поместив его в ванну с водой при 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут. Спрей ткани культуры капот поверхности с 70% этанола и протрите вниз распыленной поверхности с бумажными полотенцами.
Далее спрей среднего и клеточного отслоения раствор бутылки с 70% этанола и протрите их бумажными полотенцами. Перенесите очищенные бутылки в капюшон культуры ткани. Извлекит туморную клетку и перенесите ее в капюшон культуры ткани.
Аспирировать средний и мыть клетки с 10 миллилитров PBS. Затем добавьте в колбу два миллилитров раствора клеточного отслоения. Установите колбу вниз в капюшоне, проверяя каждую минуту, чтобы увидеть, если опухолевые клетки округлены вверх.
После того, как опухолевые клетки округляются, осторожно коснитесь стороны колбы, чтобы помочь клеткам отделиться. После этого, пипетки восемь миллилитров сыворотки свободной клеточной среды в колбу и пипетку вверх и вниз три раза смешивать. Перенесите эту клеточную суспензию в 15-миллилитровую центрифугу и центрифугу при 200 г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Аспирировать супернатанта. Затем мыть клетки в 10 миллилитров PBS, убедившись, что пипетка вверх и вниз три-пять раз, чтобы смешать. Центрифуга клетки в 200 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Аспирировать супернатант, и повторного незаменимия клеток в 10 миллилитров сыворотки свободной среды. Pipette вверх и вниз три-пять раз, чтобы смешать. Смешайте 10 микролитров этой клеточной подвески с 10 микролитров раствора Trypan Blue.
Следующая пипетка 10 микролитров Trypan Blue и клеточной смеси в счет слайд, и использовать автоматический счетчик ячейки для количественной оценки живого номера ячейки. Используйте сывороточно-свободную клеточную среду, чтобы регулировать плотность клеток в 2,5 раза от 10 до пятых клеток на миллилитр. Затем семя двух миллилитров клеток в каждый колодец из шести хорошо культуры пластины.
В то же время, подготовить шесть скважин только с двумя миллилитров сыворотки свободных стволовых клеток среды. После этого инкубировать шесть хорошо пластин при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в течение 24 часов. Первый спрей ткани культуры капот поверхности с 70%этанола и протрите вниз распыленной поверхности с бумажными полотенцами.
Далее спрей среднего и клеточного отслоения раствор бутылки с 70% этанола и протрите их бумажными полотенцами. Перенесите очищенные бутылки в капюшон культуры ткани. После этого, получить шесть хорошо пластин из инкубатора.
Тщательно пипетки кондиционированных средств массовой информации в 15 миллилитров стерильных центрифуг трубки, и место труб на льду. Добавьте 0,5 миллилитров раствора клеточного отслоения в каждый колодец из шести хорошо пластин, и проверить каждую минуту, если опухолевые клетки округлены. После того, как опухолевые клетки округлиться, осторожно нажмите сторону пластины, чтобы помочь отделить клетки.
Следующая пипетка 2,5 миллилитров среды обслуживания опухолевых клеток в колодец и пипетки вверх и вниз три раза смешивать. Перенесите клетки в 15-миллилитровую стерильную центрифугу. Смешайте 10 микролитров клеток с 10 микролитров раствора Trypan Blue и перенесите 10 микролитров этой смеси в скольжение.
Используйте автоматический счетчик клеток для количественной оценки количества живых клеток, и использовать сыворотки свободной стволовой клетки среды, которая была инкубирована на 37 градусов по Цельсию в одночасье, чтобы настроить объем условных средств массовой информации в соответствии с номером клетки. Фильтруем условные средства массовой информации через фильтры 0,45 микрометра и разуровню кондиционированные средства массовой информации на льду. Для начала разогреть IMDM среды в водяной бане при 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
Очистите ткань культуры капот с 70% этанола и очистить бутылку среднего и транспортировать его в капот, как описано ранее. Затем перенесите колбу клеток MV-4-11 в капот. Пипетка 10 миллилитров клеток в 15 миллилитров центрифуг трубки.
Используйте Trypan Blue и автоматический счетчик клеток для количественной оценки количества живых клеток, как описано ранее. Затем центрифуга клетки в 200 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Аспирировать супернатант и мыть клетки с 10 миллилитров PBS.
Центрифуга снова в 200 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Аспирировать супернатант, и повторного перерасхода клеток в среде IMDM при конечной плотности клеток один миллион клеток на миллилитр. Сначала довнесите необходимые материалы до комнатной температуры.
Добавьте в каждую вставку 250 микролитров подготовленных клеток MV-4-11. Далее добавьте 400 микролитров либо условных средних или средних только в нижние камеры 24-хорошо пластины, убедившись, что добавить образцы в тройной. Инкубационный при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение четырех часов.
Затем аккуратно коснитесь вставки на внутренней стене того же хорошо и отбросить вставку. Аккуратно пипетки клетки в колодцах вверх и вниз три раза, чтобы смешать. Перенесите 225 микролитров этой клеточной подвески в скважины черностенной пластины 96 скважин, пригодной для флуоресцентных измерений.
После этого разбавляют краситель Сикуат 4x лиз буфером в соотношении от одного до 75. Vortex кратко и спина вниз решение. Перенесите 75 микролитров этого раствора на каждую колодец 96-хорошо пластины и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
Используя считыватель пластин флуоресценции, прочитайте флуоресценцию и проанализируйте данные, изложенные в текстовом протоколе. В этом исследовании используется анализ in vitro для изучения взаимодействия макрофагов опухоли. Образцы с высокими значениями флуоресценции указывают на то, что условные средства массовой информации имеют высокую способность набирать макрофаги.
В зависимости от экспериментальной необходимости могут быть включены дополнительные элементы управления. Например, можно использовать нейтрализующие антитела для лечения условных средств массовой информации, чтобы отменить макрофаг хемотаксис и выполнять таким же образом. Можно также добавить дополнительные хемокины к условным средствам массовой информации, которые служат положительным контролем.
Важно контролировать различия в количестве клеток для этого анализа, потому что различные типы клеток могут расти с разной скоростью. Подтверждение in vivo результатов in vitro имеет решающее значение. Можно вводить опухолевые клетки мышам и анализировать опухоли с цитометрией потока, иммуностимулятором и CyTOF, чтобы подтвердить результаты.
