Анализ липопротеинов плазмы очень важен для диагностики гиперлипидемии и исследования атеросклероза. В этом протоколе, мы введем основной метод с использованием ультрацентрифугации для изоляции плазменных липопротеинов. Этот метод позволяет исследователям использовать один миллилитр плазмы, чтобы изолировать семь фракций липопротеинов.
Эти фракции могут быть использованы для липидов, аполипопротеинов, а также хорошо функциональные исследования Этот метод может быть применен как для человека и животных образцов для диагностики дислипидемии и связанных с ней заболеваний. Начните с переноса одного миллилитра плазмы в каждую поликарбонатную ультрацентрифугную трубку. Затем загрузите трубки в ротор с фиксированным углом и центрифуга плазмы в 356 000 раз G в течение 2,5 часов при четырех градусах цельсия.
Отрегулируйте положение лезвия в срезе трубки до уровня между верхней фракцией и нижней фракцией. Вырезать трубки с помощью срез и собирать верхнюю фракцию, около 200 микролитров, в новую микротрубку. Соберите оставшуюся нижнюю фракцию в новую поликарбонатную ультрацентрифугную трубку для следующего отделения.
Отрегулируйте общий объем до 800 микролитров, добавив тот же раствор плотности. Отрегулируйте нижнюю фракцию до плотности 1,02 грамма на миллилитр, добавив 58,9 микролитров по 1,21 грамма на миллилитр раствора и 141,1 микролитров по 1,02 грамма на миллилитр раствора для общего объема одного миллилитра. Загрузите эти трубки в ротор с фиксированным углом и центрифугу при 356 000 раз G в течение 2,5 часов при четырех градусах Цельсия.
Продолжить сбор верхних фракций, регулируя плотность нижних фракций, и центрифугирование для плотности фракций 1,02, 1,04, 1,06, 1,08, 1,1 и 1,21 грамма на миллилитр. Для окончательного ультрацентрифугации центрифуга при 513 000 раз G в течение четырех часов при четырех градусах Цельсия. Липопротеин профили кроликов кормили либо нормальной стандартной диеты или высокого уровня холестерина диеты показаны здесь.
Кролики травоядные, поэтому их уровни TC плазмы, TG, и PL вообще более низки чем то из людей и мышей. В нормальных стандартных диеты кормили кроликов, ТК в основном распространяется в HDL3 и ЛПНП. В диких кроликах типа на нормальной стандартной диете, 39% плазмы TG распределены в VLDLs, тогда как 57% плазмы PL содержится в HDL3.
Когда кролики были оспорены с высоким уровнем холестерина диеты, они быстро развивались гиперхолестеринемии. Их профили липопротеинов характеризовались заметной высотой VLDLs. Семь фракций липопротеинов от диких кроликов типа кормили либо нормальный стандарт или высоким уровнем холестерина диеты были запущены на SDS полиакриламид гель и визуализированы с CBB окрашивания.
На диете с высоким уровнем холестерина, как ApoB-100 и ApoE содержание в VLDLs, IDLs, и LDLs были заметно повышены. Западный blotting был использован для сравнения аполипопротеинов и липопротеинов профилей трех различных гиперлипидемических кроликов: высокий уровень холестерина диеты кормили диких кроликов типа, ApoE нокаут кроликов, и Watanabe Heritable гиперлипидемических кроликов с дефицитом рецепторов ЛПНП. ApoB, содержащий частицы высокого холестерина диеты кормили диких кроликов типа характеризуются увеличением ApoB-100 и ApoE содержание, в то время как ApoE нокаут кроликов показали увеличение ApoB-48 вместе с появлением ApoA-1.
Ватанабэ Геритая гиперлипидемические кролики генетически недостаточно в функциях рецепторов ЛПНП, поэтому заметное увеличение ApoB-100 в LDLs сопровождается снижением ApoA-1 в HDLs было отмечено, подобно человеческой семьи гиперхолестеринемии пациентов. Восстановление образца является наиболее важным в этой процедуре. Чтобы свести к минимуму потерю образца, следует быть осторожным, чтобы собрать фракцию и полностью растворить вязкие осадки в нижней фракции.
После сбора семи фракций липопротеинов, диализ требуется для сортировки. После завершения диализа образцы липопротеинов для анализа с использованием страницы SDS, западного blotting и клеточного исследования. В клинических условиях ультрацентрифугация обычно разделяет липопротеины на четыре фракции.
Текущий метод может изолировать семь фракций липопротеинов, что обеспечивает более подробную информацию о липопротеинах для исследования гиперлипидемии.
