Подготовка децеллюляризованных каркасов почек у крыс

Этот протокол позволяет разрабатывать васкуляризированные каркасы с использованием почек в модели крысы. Почка является наиболее подходящим органом для каркасов дифференцированных стволовых клеток. Это очень успешный протокол для децеллюляризации почки.

Эффективно удаляет ядра с минимальным разрушением ультраструктуры ECM. Этот метод может быть применен к трансплантационной медицине и тканевой инженерии. Продемонстрировать процедуру будет Ким Джу Хён, адъюнкт-профессор пластической хирургии из моей лаборатории.

Для начала поместите восьминедельную крысу Sprague Dawley на согревательную подушку и поместите ректальный термометр в прямую кишку, чтобы контролировать температуру ядра. После обезболивания крысу поместите ее в лежачем положении и закрепите четыре конечности к столу скотчем. Побрить и очистить живот бактерицидным мылом.

Нанесите 2% бетадина в течение по крайней мере одной-двух минут, затем протрите его 70%-ным раствором этанола. Повторите эту последовательность три раза. Накройте операционное поле стерильной, фенестрированной драпировкой.

Сделайте вертикальный разрез брюшной полости и обнажите левую почку, мочеточник, брюшную аорту и нижнюю полую вену. Рассекните ткань непосредственно перед разрезанием ножи. Приготовьте 50 миллилитров перфузионного раствора на крысу, смешивая PBS примерно с 10 единицами на миллилитр гепарина.

Смешайте равные объемы 8% PFA с PBS, чтобы получить раствор 4% PFA. Вытяните вертикальный разрез брюшной полости кранизно, обязательно оттягивая ножницы от органов при разрезании, чтобы избежать повреждения. Продолжайте разрез через грудную клетку, а затем разрезайте диафрагму, подняв грудину.

Убирайте рыхлый лоскут кожи с дороги с помощью зажима Allis и освободите сердце, разрывая любую соединительную ткань щипцами. Откройте линию PBS и убедитесь, что она течет, прежде чем помещать иглу в левый желудочек. Осторожно держите сердце тупыми щипцами и используйте гемостат для управления иглой.

Иглу следует вводить не более чем на четверть дюйма. Поддерживая сердце иглой и гемостатом, найдите правое предсердие и прорежйте его ножницами иридэктомии. Положите гемостат на тело крысы и убедитесь, что игла все еще расположена внутри сердца.

Продолжайте перфузию PBS в течение четырех минут или дольше, если в почках и печени все еще видна кровь. Собирают левую почку с брюшной аортой и нижней полой веной. Лигата мочеточника, грудной аорты, верхней полой вены и ветвей брюшной аорты.

Держите орган гидратированным в DPBS в 10-сантиметровой чашке Петри. Канюлюляция брюшной аорты и нижней полой вены с помощью катетера 23-го калибра. Для удаления остаточной крови соедините канюлю с перистальтическим насосом, и промыть орган 500 миллилитрами DPBS и 16 единицами на миллилитр гепарина в течение 90 минут при пяти оборотах в минуту и 37 градусах Цельсия.

Для децеллюляризации почки перфузируют ее 1% тритоном Х-100 в течение трех часов, а затем 0,75% раствором SDS в течение шести часов при постоянном давлении 40 миллилитров ртути. Чтобы удалить остаточный SDS, перфьмин 1% пенициллина в дистиллированной воде в течение 18 часов, а затем стерильным DPBS и 16 единицами на миллилитр гепарина в течение 90 минут. Грубая морфология почек крыс была темно-красной.

После децеллюляризации почка стала бледной и полупрозрачной. Остаточная геномная ДНК была количественно определена в децеллюляризированных каркасах почек и сравнивалась с таковой в нативных почках, подтверждая, что геномная ДНК тканей была почти устранена после децеллюляризации. Из 14 случаев среднее содержание ДНК составляло 115,05 нанограмм на микролитр для контроля и 1,96 нанограмма на микролитр для децеллюляризированного каркаса.

В общей сложности было удалено 98,3% ДНК. Трехмерная структура была сохранена, а в кортикальной паренхиме сохранились бесклеточные клубочки. При введении иглы в левый желудочек ее следует вводить не более чем на четверть дюйма.

Любая дальнейшая вставка может выйти с другой стороны. Мы уверены, что данная методика откроет новую перспективу в области тканевой инженерии.