Этот метод может быть использован для углубления нашего понимания обработки кальция в нейронах и того, как компартментализированный кальций может регулировать различные механизмы, важные для функции нейронов in vivo. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет получать более высокую разрешающую быструю визуализацию in vivo в физиологических условиях у C.elegans, которые можно комбинировать с другими флуоресцентными инструментами. Этот метод может дать представление о механизме, регулирующем передачу сигналов кальция в нейронах во многих различных контекстах.
Например, при старении, повреждении нейронов и нейродегенерации. Эту процедуру продемонстрирует Эннис Дейл, техник-исследователь. Каз Найт, кандидат наук, и Рэйчел Досер, научный сотрудник моей лаборатории.
Начните с клонирования векторов экспрессии, которые содержат промотор, за которым следует индикатор кальция и три основных UTR по выбору. Создание трансгенных штаммов C.elegans путем микроинъекции смеси ДНК, содержащей спасательную ДНК Lin-15 plus в трансгене индикатора кальция, в гонаду однодневного взрослого C.elegans. Поддерживайте введенных родительских червей при температуре 20 градусов по Цельсию до тех пор, пока потомство F1 не достигнет совершеннолетия.
Выберите трансгенных взрослых путем скрининга на отсутствие фенотипа мультивульвы. Это указывает на экспрессию дополнительного хромосомного массива, содержащего кальциевый индикатор. Клональное прохождение взрослого потомства F1, не имеющего фенотипа мультивульвы.
Проведение экспериментов на последующих поколениях трансгенных штаммов с оптимальной экспрессией кальциевого показателя. Используйте микроскоп, способный к длительной покадровой съемке. Найдите червя под объективом с малым увеличением, а затем переключитесь на объектив с большим увеличением, чтобы локализовать нейроны.
Получайте изображения с помощью сверхчувствительной камеры, способной быстро получать изображения со скоростью более 50 кадров в секунду. Далее используйте стандартный эмиссионный фильтр для индикатора кальция. Добавьте корректор Z-дрейфа для получения потоков изображений продолжительностью более 10 секунд.
В стеклянной пробирке размером 13 на 100 миллиметров приготовьте три миллилитра 10%-ного агара, растворив молекулярный агар в M9, и разогрейте в микроволновой печи в течение нескольких секунд. Чтобы сделать агаровые подушечки, сначала подготовьте два предметных стекла, добавив два слоя лабораторной ленты. Затем поместите предметное стекло микроскопа между двумя предметными стеклами.
Отрежьте наконечник наконечника пипетки объемом 1000 микролитров и используйте его, чтобы нанести небольшую каплю агара на центр покровного стекла. Расплющите агар, нажав еще один слайд вниз поверх агара. После остывания разрежьте агар на небольшой диск, используя отверстие 10-миллилитровой пробирки, а затем удалите окружающий агар.
Затем приготовьте раствор для червячного проката, растворив порошок мусцимола в M9, чтобы создать 30-миллимолярный запас. Разбавьте бульон в соотношении один к одному шариками полистирола, чтобы получился раствор для прокатки. Чтобы расположить червя для визуализации, сначала поместите 1,6 микролитра раскатывающегося раствора в центр агаровой подушечки.
Затем, используя предпочитаемую червячную кирку, перенесите червя нужного возраста в раскатистый раствор на агаровой подушечке. Подождите около пяти минут, пока мусцимол уменьшит движение червя, а затем бросьте покровное стекло размером 22 на 22 миллиметра поверх агаровой подушечки. Для визуализации невритов в вентральном нервном мозге сверните червя, слегка сдвинув покрывало.
Чтобы закрепить червяка на микроскопе, нанесите каплю иммерсионного масла на покровное стекло. Найдите червя с помощью объектива с малым увеличением в светлом поле. Затем переключитесь на 100-кратный объектив и найдите нейрит AVA с помощью подсветки GCaMP или mito GCaMP с помощью 488-нанометрового лазера визуализации.
Для визуализации in vivo GCaMP отрегулируйте лазер визуализации в настройках сбора данных до тех пор, пока флуоресценция базилика GCaMP не окажется в среднем диапазоне динамического диапазона камеры, и установите время экспозиции на 20 миллисекунд. После того, как нейрит AVA обнаружен с помощью флуоресценции GCaMP при 100-кратном увеличении, установите корректор Z-дрейфа и инициируйте непрерывную автофокусировку. Перед получением изображения вручную скорректируйте фокальную плоскость по мере необходимости.
Получение потока изображений со 100-кратным увеличением. Используя этот протокол, цитоплазматический кальций измеряли с высоким временным и пространственным разрешением. Клеточная специфическая экспрессия GCaMP6F в глутаматергических интернейронах команды AVA выявила направленное распространение притока кальция.
Субклеточная количественная оценка флуоресценции GCaMP6F показала, что начало притока кальция было задержано в части нейрита, расположенной всего в 10 микрометрах. Кроме того, дендритные шиповидные структуры, обнаруженные вдоль нейрита AVA, показали вспышки флуоресценции GCaMP6F, которые происходили независимо от активации нейритов и не приводили к распространению притока кальция. Кроме того, относительные уровни кальция были измерены в отдельных митохондриях при одиночных нейритах с использованием штамма червя со специфической экспрессией AVA локализованного кальциевого индикатора митохондриального матрикса mito GCaMP.
Результаты показали синхронное поглощение относительно большого количества кальция в подмножество митохондрий. В частности, поглощение кальция некоторыми митохондриями было синхронизировано, тогда как соседние митохондрии, по-видимому, не поглощали кальций. Точно так же подмножества митохондрий показали быстрое поглощение и высвобождение небольших количеств кальция.
Это также оказалось синхронным, но только для подмножества митохондрий. Скорость и тонкие манипуляции необходимы для позиционирования животных и сохранения функции нейронов. Здоровье животных также имеет первостепенное значение.
Даже немного поголодать проблематично. Сложнее всего освоить быструю ориентацию животных для конфокальной микроскопии без повреждений. Мой совет - много практики и хороший контроль.
Этот протокол может быть применен к экспериментам, в которых кальций высвобождается из других субклеточных мест в нейронах, других нейронов или клеток, отличных от нейронов в C.elegans. Поскольку этот подход у C.elegans оставляет животных нетронутыми, можно решить вопросы о регуляции субклеточного обращения с кальцием in vivo в отдельных нейронах полной нервной системы.
