ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

要約

遺伝子のマイクロアレイはゲノムワイドなレベルでの遺伝子発現プロファイリングの強力なツールです。この技術は、発生生物学や毒物学を含む生物学的な分野の様々なアプリケーションを持っています。このビデオでは、我々は詳細ゼブラフィッシュのための包括的なオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析用プロトコルを。

要約

遺伝子マイクロアレイ技術はゲノムワイドに転写レベルの定量的測定と遺伝子発現プロファイリングを可能にする。遺伝子マイクロアレイ技術は、疾患の状態への発達段階との関係でグローバルな遺伝子発現解析など、さまざまな用途で多くの生物学的分野、及び毒性応答で使用されています。ここで、我々は包括的なゼブラフィッシュ特異的オリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析のデモンストレーションが含まれています。ゼブラフィッシュの発現のマイクロアレイプラットフォームは、ターゲットごとに最大12のプローブと37157目標を問い合わせる385000プローブ、長さ60塩基対が含まれています。このプラットフォームでは、ゼブラフィッシュで使用可能なすべてのcDNAおよびゲノム情報は、Ensemblの（http://www.ensembl.org）、VEGA（http://vega.sanger.ac.uk）、UCSC（を含む様々なゲノムデータベースから収集されたhttp://genome.ucsc.edu）、およびZFIN（http://www.zfin.org）。その結果、この式の配列は、現在のゼブラフィッシュのトランスクリプトームの完全なカバレッジを提供します。ゼブラフィッシュの発現のマイクロアレイは、ロシュNimbleGen（マディソン、WI）によって印刷された。この技術デモは、cDNA産物、マイクロアレイプラットフォームへの標識cDNA産物のハイブリダイゼーション、およびつの色の分析の戦略を使用して信号集録をスキャンする配列の蛍光標識が含まれています。

プロトコル

パート1：cDNAの蛍光標識

マイクロアレイ実験で使用されているのCy3色素は、光分解に敏感です。手順は、光の最小の量で行われるべきである。ラベリングのプロトコールは、マニュアル¹ BioPrimeアレイCGHゲノムラベリングシステムから翻案されました。

1. ラベリング反応の試薬は-20℃で保存されていますBioPrimeアレイCGHゲノムラベリングシステムの雪解け2.5Xランダムプライマーバッファ、10X dCTPをミックス、およびヌクレアーゼフリー水から。また、Cy3でdCTPを染料を解凍。解凍後、一時的に使用する前に全ての試薬を軽く遠心する。
2. 別のラベリング反応には分析する各cDNAサンプルのために完了する必要があります。 0.6ミリリットル厚肉チューブに86μlの合計量を達成するために500ngのcDNAを、40μlの2.5倍のランダムプライマーのバッファとヌクレアーゼフリー水を加える。
3. よく混和後スピンダウンする。 100で5分間反応をインキュベートしますクラー上でCを。
4. 直ちに10分間氷浴のスラリーに反応して転送する。
5. 各チューブにして10μlの10X dCTPをミックス、2μlを1mMのCy3でdCTPおよび2μlのエキソKlenow DNAポリメラーゼを追加。エキソKlenow DNAポリメラーゼが必要になるまで冷凍庫ままにしておく必要がありますし、常に....

ディスカッション

ここで詳述するものを含む多くのマイクロアレイのプロトコルは、、ハイブリダイゼーションを測定し、定量化の手段として蛍光染料を使用してください。 Cy3の蛍光色素は、写真とオゾン劣化に敏感である。それは手順が最小限の照明で行われることをお勧めします。さらに、小さなダスト粒子は、ハイブリダイゼーションとスキャニングの妨げになることがあります。特別な注意が作業領.......

資料

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Array Microcentrifuge Dryer		ISC Bioexpress	C-1303-T
BioPrime Array CGH Genomic Labeling System		Invitrogen	18095-011
Cyanine 3-dCTP		PerkinElmer	NEL576
GenePix 4000B		Molecular Devices	GENEPIX 4000B
Microcon YM-30		Millipore	42411
NimbleGen Array Processing Accessories		Roche NimbleGen	5223539001
NimbleGen Hybridization Kit		Roche NimbleGen	5223474001
NimbleGen Hybridization System 4		Roche NimbleGen	5223652001
NimbleGen Wash Buffer Kit		Roche NimbleGen	5223504001
X1 Mixers		Roche NimbleGen	5223725001