Hawaii Bobteylleri Squid Hemocytes Alınması Euprymna scolopes Ve Simbiyotik ve Non-Simbiyotik Bakteriler bağlılık Gözlem

Özet

Bu video, Hawaii kuyruğu kesik kalamar hemocytes (kan hücreleri) elde etmek için nasıl göstereceğiz Euprymna scolopes Hücre biyolojik ve bakteriyel adezyon tayinlerde kullanım için. Hemocytes floresan boya ile boyanmış ve GFP-etiketli bakterilere maruz kalacak.

Özet

Bağışıklık sisteminin moleküler sinyal yararlı bakteri ve ev sahipleri arasında arabuluculuk rolü ile ilgili çalışmalar, son yıllarda, kendi Mikrobiyota ökaryotlarda eş-evrim anlayışımıza önemli katkılarda bulunmuşlardır. Hawaii kuyruğu kesik kalamar arasındaki simbiyotik ilişki,

Protokol

1. 0.22 mikron filtre ile sterilize edilmiş yapay deniz suyu, 500 mL (tuzluluk 35 ppt FSW) hazırlayın. 0.22 mikron mikron filtre süzülür yapay ya da doğal deniz suyu parçacıklar ve bakteriler kaldırmak için.
2. FSW etanol% 2'lik bir çözüm koyarak bir yetişkin Hawaiian kuyruğu kesik kalamar (Euprymna scolopes) anestezisi. Yaklaşık 10 dakika için anestezi hayvan yerleştirin. Kalamar yüzme sona erecek ve aktif dokunmatik yanıt vermez. Devamı solunum, manto hareket tarafından belirtilen ve chromatophore aktivite hala dikkat edilmelidir.
3. Kalamar, standart bir balmumu diseksiyonu tepsisine yukarı bakacak şekilde ventral yüzü koyun. FSW% 2 oranında etanol içeren hayvan Batmak.
4. Bir standart 200 ul pipet uçları kullanarak, huni ve manto, iki göz arasında bulunan ana sefalik kan damarı ortaya çıkarmak için geri çekin.
5. 26.5 iğne, delinme sefalik kan damarı ve hemolimf 50-100 ul arasında çekilme ile 1 ml steril bir şırınga kullanarak. 1,5 mL steril bir tüp içinde buz üzerinde hemolimf yerleştirin.
   Not: bir hayvan birden çok kez bir bağış olarak hizmet verecek herhangi bir zamanda, sadece 10-20 ul hemolimf çekilme. Normal bir deniz suyu tankı hayvan dönün. 30 dakika içinde hayvan ihya edecek.
6. Taze toplanan hemocytes 500 ul Squid Ringer solüsyonu (530 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 MgCl ₂ mM, 10 mM CaCl ₂ ve 10 mM HEPES tamponu, pH 7.5, S-Zil) ile yıkandı ve tekrar askıya alınır.
7. Hemocyte konsantrasyonları hemasitometre tarafından belirlenir ve yaklaşık 2.000 hücre odacıklı cam kapak fişleri eklenir ve oda sıcaklığında 10 dakika için cam uymak için izin verilir. Bu yoğunluk, hemocytes cam slayt yüzeyinde düzgün bir tek tabaka oluşturur.
8. Konak hemocytes bağlayıcı bakteri gözlemlemek için, hemocytes Vibrio fischeri ES114 ve / veya Vibrio harveyi B392, her bir yeşil floresan muhabiri içeren gibi floresan etiketli bir bakteri suşunun maruz kalmaktadır. V. fischeri ES114 ve V. harveyi B392 28 deniz suyu Tripton medya (cc) orta-log fazı ° C orbital çalkalayıcı yetiştirilmektedir. 600Nm optik yoğunluk hücre yoğunluğu belirlemek için spektrofotometrik olarak ölçülür. Bakteri santrifüj (5 dakika için 5.000 rpm) pelet, süpernatantı atılır ve pelet S-Zil sesleri yeniden askıya alınır.
9. 100,000 bakteri hücrelerinin de bu yüzden başına 50 ortalama hemocyte bakteri olduğunu her iki mecliste de eklenir. Hemocyte / bakteri karışımları S-Ringer solüsyonu 25 ° C 1 saat, bağlama maksimum düzeyde verim belirlenen bir süre inkübe edilir.
10. Sitoplazma hemocytes sonra floresan% 0.005 CellTracker Orange (Invitrogen) ile boyandı ve sonra hücrelerin görselleştirmek için S-Zil yıkanır.
11. Ilişkili bakteri ile Vitray hemocytes bir Zeiss Discovery V20 floresan Stereoskop veya Leica SP2 spektral lazer konfokal mikroskop ya kullanılarak floresans tarafından görüntülenebilir ve hayvan hücre, tüm yüzey üzerinde numaralandırılan.

Temsilcisi Sonuçlar

Kafadan hemolimf oksijenasyon üzerine ekstrasellüler hemosiyanin ve hemoglobin içerdiğinden hemolimf, koyu mavi dönecektir. Bu yöntemi kullanarak ~ 5000 hemocytes hemolimf, ul başına ortalama elde edilecektir. Odacıklı kapak fişleri ve floresan boyama bağlılık sonra, hemocytes şeklinde parlak floresan kırmızı ve amoeboid görünmelidir. Bakteriyel yapışma için, V. fischeri ise V. (1-2 bakteri hücrelerinin kan hücresi başına) hemocytes kötü uyacaktır harveyi (ortalama 10-15 bakteri hücrelerinin hemocyte) Kesinlikle uyacaktır.

Şekil 1. Yetişkin Hawai kuyruğu kesik kalamar Euprymna sefalik kan geminin konumunu gösteren scolopes.

Şekil 2 Vibrio fischeri (A) ve Vibrio harveyi (B) hemocyte maruz kalma. : Kırmızı, Hücre Tracker Turuncu, Yeşil, GFP-etiketli bakteri.

Tartışmalar

Bağışıklık sisteminin moleküler sinyal yararlı bakteri ve ev sahipleri arasında arabuluculuk rolü ile ilgili çalışmalar, son yıllarda, kendi Mikrobiyota ökaryotlarda eş-evrim anlayışımıza önemli katkılarda bulunmuşlardır. Squid / vibrio sistemi, bu ^alanda 2,3,5,6,8 temel soruları yanıtlamak için bir uysal bir model sistem olarak kendini kanıtlamıştır. Kalamar Euprymna scolopes ışık organ ışık bakteri Vibrio fischeri tarafından özel olarak kolonizasyon iz...

Malzemeler

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers)		Thermo-Fisher Scientific	155411
26.5 G 1ml latex-free insulin syringe		Becton, Dickinson and Company	C34551
Cell Tracker Orange		Invitrogen	C34551
SteREO Discovery V20 Microscope		Zeiss
SP2 Confocal Microscope		Leica