PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

Trascrizioni di RNA sono sottoposti a regolazione post-trascrizionale genica interagendo con centinaia di RNA-binding proteins (RBPs) e microRNA contenenti complessi ribonucleoproteina (miRNPs) che sono spesso espressi in una cellula di tipo dipendente. Per capire come l'interazione di questi RNA-binding fattori influisce sulla regolazione della trascrizione individuale, mappe ad alta risoluzione in vivo le interazioni proteina-RNA sono necessari ^1.

Una combinazione di fattori genetici, biochimici e approcci computazionali sono generalmente applicati per individuare l'RNA-RBP o RNA-RNP interazioni. Profiling microarray di RNA associate a RBPs immunopurified (RIP-Chip) ² definisce gli obiettivi a livello del trascrittoma, ma la sua applicazione è limitata alla caratterizzazione delle interazioni cineticamente stabile e solo in rari casi ^3,4 permette di identificare l'elemento RBP riconoscimento (RRE ) all'interno del RNA bersaglio lungo. Più diretto obiettivo informazioni RBP sito è ottenuto dalla combinazione di reticolazione UV ^5,6 vivo con immunoprecipitazione ^7-9 seguito da l'isolamento reticolato di segmenti di RNA e sequenziamento del DNA (CLIP) ^10. CLIP è stato utilizzato per identificare gli obiettivi di un certo numero di RBPs ^11-17. Tuttavia, CLIP è limitata dalla scarsa efficienza dei raggi UV 254 nm RNA-proteina reticolazione, e la posizione della reticolazione non è facilmente individuabile all'interno dei frammenti sequenziati reticolato, il che rende difficile separare reticolati UV bersaglio segmenti di RNA da sfondo non reticolati anche frammenti di RNA presenti nel campione.

Abbiamo sviluppato una potente cellula approccio basato reticolazione a determinare in alta risoluzione e trascrittoma livello i siti di legame di RBPs cellulare e miRNPs che chiamiamo PAR-Clip (Photoactivatable-ribonucleosidi-Enhanced reticolazione e immunoprecipitazione) (vedi fig. 1A per uno schema del metodo). Il metodo si basa sulla costituzione di analoghi ribonucleosidi fotoreattivo, come thiouridine 4-(4-SU) e 6-thioguanosine (6-SG) nella nascente trascrizioni di RNA da cellule viventi. L'irradiazione delle cellule dalla luce UV di 365 nm induce la reticolazione efficiente delle fotoreattivo nucleosidi marcati RNA cellulare RBPs interagenti. Immunoprecipitazione della RBP di interesse è seguita da isolamento del RNA reticolato e coimmunoprecipitated. L'RNA isolato è trasformata in una libreria di cDNA e profondo in sequenza usando la tecnologia Solexa. Una caratteristica di librerie cDNA preparati da PAR-Clip è che la posizione precisa di reticolazione può essere identificata da mutazioni che risiedono nella sequenza del DNA. Quando si utilizza 4-SU, sequenze reticolato timidina di transizione citidina, mentre l'uso di 6-SG risultati in guanosina di adenosina mutazioni. La presenza di mutazioni in sequenze reticolato rende possibile la loro separazione dallo sfondo di sequenze derivate da abbondanti RNA cellulare.

Applicazione del metodo ad una serie di diverse proteine ​​RNA binding è stata riportata in Hafner et al ^18.