PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

RNA의 성적은 RNA 결합 단백질의 수백 (RBPs)와 microRNA 함유 자주 dependently 셀 타입에 표현 ribonucleoprotein의 단지 (miRNPs를.)와 상호 작용하여 포스트 transcriptional 유전자 규정의 대상이 아르 이해하는 방법을 다음과 RNA 바인딩 요소의 상호 작용은 개인 성적, 생체내 단백질 - RNA 상호 작용 ¹ 필요의 고해상도지도의 규정에 영향을 미칩니다.

유전자, 생화학 및 전산 접근 방식의 조합은 일반적으로 RNA - RBP 또는 RNA - RNP 상호 작용을 파악하기 위해 적용됩니다. immunopurified의 RBPs과 관련된 RNAS의 Microarray 프로 파일링 (RIP - 칩) ² transcriptome 수준 목표를 정의하지만, 그 응용 프로그램은 kinetically 안정적인 상호 작용에만 드문 경우 ^3,4는 RBP 인식 요소 (RRE을 식별할 수의 특성으로 제한됩니다 ) 긴 목표 RNA 이내. 더 직접적인 RBP 대상 사이트 정보 가교 RNA 세그먼트와 cDNA 시퀀싱 (CLIP) ^10의 절연 다음 immunoprecipitation ^7-9로 생체내의 자외선 crosslinking ^5,6에 결합하여 얻을 수 있습니다. 클립 RBPs ^11-17의 다수의 대상을 식별하는 데 사용되었다. 그러나, 클립 UV 254 nm의 RNA - 단백질 crosslinking의 낮은 효율에 의해 제한되며, crosslink의 위치는 어려운 배경 이외의 가교에서 UV - 가교 대상 RNA 세그먼트를 분리하고, 합성 가교 조각 이내에 쉽게 식별이되지 않습니다 RNA는 또한 샘플에 존재 조각.

우리는 높은 해상도와 셀룰러 RBPs 및 miRNPs의 transcriptome 전체 바인딩 사이트에서 확인하기 위해 강력한 세포 기반 crosslinking 접근을 개발 우리가 용어 PAR - 클립 (Photoactivatable - Ribonucleoside 강화 Crosslinking 및 Immunoprecipitation) (개요에 대한 그림. 1A를 참조하십시오 방법). 방법은 살아있는 세포에 의해 초기 RNA의 성적에 같은 4 - thiouridine (4 - SU)과 6 - thioguanosine (6 - SG)로 photoreactive ribonucleoside의 analogs의 결합에 의존하고 있습니다. 365 NM의 자외선에 의한 세포의 방사선이 상호 작용 RBPs에 photoreactive 뉴클레오 - 라벨 세포 RN​​AS의 효율적 crosslinking을 유도. 관심 RBP의 Immunoprecipitation은 가교와 coimmunoprecipitated RNA의 분리옵니다. 절연 RNA는 cDNA 라이브러리로 변환하고 깊은 Solexa 기술을 사용하여 합성 수 있습니다. PAR - 클립 준비한 cDNA 라이브러리 중 하나 특징은 crosslinking의 정확한 위치가 합성 cDNA에 거주하는 돌연변이에 의해 식별 될 수있다는 것이다. 변이를 아데노신에 구아 노신 6 - SG 결과를 사용하는 반면 cytidine 전환 4 - SU을 사용하여, 가교 시퀀스 thymidine. 가교 시퀀스에있는 돌연변이의 존재는 그것이 가능한 풍부한 휴대 RNAS에서 파생 시퀀스의 배경에서 분리 수 있습니다.

다양한 RNA 바인딩 단백질의 숫자 방법의 응용은 Hafner 외에 보도되었다. ¹⁸