C. elegansの正ブタノンの学習、短期、および長期連想記憶アッセイ

Summary

ここでは、線虫の連合学習と短期と長期の連想記憶をテストする方法を説明します。これらの人口のアッセイは、揮発性の臭気物質に向かってchemotaxにワームの能力を採用しており、走化性ブタノンで食べ物をペアリング時に正の関連付けを形成する。コンディショニング期間の数を増やすと、長期記憶を誘導する。

Abstract

経験の記憶と学習された情報は、彼らの生存を助ける選択をすることが生物にとって非常に重要です。C.虫は、食品や薬品臭い^1、2のニューロン特異的検出によってその環境をナビゲート、および化学臭^3、温度^4、食料源⁵の病原性と栄養状態を関連付けることができます。

ここで、我々はC. elegansの連合学習と短期的および長期的連想記憶のアッセイを説明します。我々は、代わりに肯定的な応答を生成するために嫌悪嗅覚学習のパラダイム^6を修正した;アッセイは、低走指数（同様のを誘発する濃度でAWCニューロン検知された揮発性誘引物質のブタノンの存在下でワームを送り、約400ワームを飢え含むToroyama ら ⁷まで）。標準人口はassay1テスト直ちに匂いやコンディショニングの後、数分から数時間へのワームの魅力を走化性。

ブタノン増加にエアコン、野生型動物の走化後〜0.6化学走性指数のユニット、その"学習インデックス"。連合学習では訓練中の食料とブタノン両方の存在に依存しています。単一のコンディショニング期間（"密集した研修"）のためのペアリング食べ物とブタノン〜2時間持続する短期的な連想記憶を生成します。 （"間隔トレーニング"）との間の休息期間を持つ複数のコンディショニング期間は、長期的な連想記憶を（<40時間）が得られる、およびcAMP応答エレメント結合タンパク質^{（CREB）、6}間の長期記憶に必要な転写因子に依存しています種^8。

我々のプロトコルはまた、走化性指標の迅速かつ正確に測定するための画像解析のメソッドが含まれています。走化性アッセイプレート上の動物の高コントラストな画像は、Matlabのワームカウントソフトウェアにより取り込まれ、分析されます。ソフトウェアは、形態学的なトップハット変換を用いて不均一なバックグラウンドを補正⁹大津の方法は、背景とは別のワームにしきい値を決定するために使用されます^。10非常に小さな粒子は、非ワームの領域（プレートのエッジや寒天のパンチ）を自動的に削除され、大きくされている手動選択して除去。ソフトウェアは、指定された最大サイズを超える領域を無視し、残りの領域のメジアン径をとることによって、単一のワームのサイズを見積もります。ワームの数は、単一のワームの推定サイズによってワームによって占有として識別総面積で除して推定される。

我々は、学習と短期と長期記憶を区別することができることを見出し、そしてこれらのプロセスは、高等生物と同様の重要な分子を共有していること^。6,8私たちのアッセイは、迅速に新たな候補遺伝子や学習と短期または長期に影響を与える分子をテストすることができます。 C.における長期記憶種間関係のあるエレガンス 。

Protocol

これらのC. elegansの連合学習と記憶のアッセイは、事前準備が必要です。準備の推奨スケジュールについては、図1Aに示したタイムラインを参照してください。また、ワームの記憶が物理的な攪拌（ラフピペッティング、遠心分離、ボルテックス）によって邪魔されることに注意して、そしてその素朴な走化性は、環境内の過剰な匂い（香水など）によって摂動することができます。

1。アッセイのための動物の準備

1. （レシピのセクション7.1を参照）を1 mL OP50 E.を接種した100ミリメートルの高成長培地（HGM）プレート上でワームの育成標準的な方法を用いて大腸菌 ¹¹
2. 卵の大規模な同期の人口を得るために妊娠した成虫の少なくとも二つの人口密度の高いHGMプレートを次亜塩素酸扱います。
   注：最高の収量は、漂白剤第一世代は、後続のステップのための卵を得るためにして漂白剤、2日目大人として第二世代を高度に同期化人口を得るために。
3. 均等に1 mLのOP50 E.を接種した3月4日HGMのプレート上に卵を割るそれぞれの次亜塩素酸塩処理されたプレートの大腸菌 。
   注：ワームは、飢餓などの生鮮食品をたっぷり使って栽培されていることが重要なのは嗅覚アッセイの結果に影響を与える可能性が。
4. 約72時間20℃でワームをインキュベートし、それが動物のために要する時間は、若い成人の段階に達する。

2。プレコンディショニング飢える

1. ワームはまだ食べ物がたくさんある、と分析のための十分なワームが（アッセイプレート当たり≥200ワーム）があることを確認するために若い大人おHGMプレートを再確認してください。
2. 15 mLコニカルチューブにM9バッファ¹¹とHGM板からワームを洗い流してください。洗浄中に少なくとも撹拌のために、優しくHGMプレートの上に数ミリリットルを注いでM9のバッファを適用し、ゆっくりと粘着OP50細菌から無料のワームにスワールプレートを。次に、プレートを傾け、P1000 pipetmanを使用して、プレートの隅からM9バッファー/ワーム混合物をプルアップし、15 mLコニカルチューブにワームを転送する。ワームがまだ板に残っている場合、このステップ1 - 2Xを繰り返す。
   注：ラフワームとチューブにそれを作ることができる板のdislodgesの細菌を洗い流した。この細菌は、取り除くこととアッセイに干渉することが不可能です。これは、ワームを損傷し、アッセイに干渉することができるように、 チューブの側面にワームをピペッティングしないでください 。
3. （ 遠心分離しないでください ）ワームは、重力によって解決しましょう。真空で上清を除去し、M9の少なくとも3-4 mLで洗う。 3回洗浄の合計のために2倍繰り返します。
   注：洗浄時の遠心分離は、アッセイに干渉することができる、ワームの集団に残っている細菌をプルダウンします。代わりに、穏やかに15 mLコニカルチューブに直接それを注ぐことによって、その後の洗浄用M9バッファーを添加します。チューブの底に定住ワームは、その添加によりM9バッファーで混合しておく必要があります。ワームが定住とどまれば、穏やかに混合してチューブを反転させる。
4. 第三洗浄した後、素朴な走化性アッセイ（セクション5）のためにワームの人口の一部を使用してください。
   注：ワームは、彼らがブタに向かって素朴な走化性を向上させることができるM9バッファー、あまりにも長く座っても餓死し始めるとそれは、すべての洗浄ステップでかなり迅速に作業することが重要です。
5. 15 mLコニカルチューブにM9バッファー3-4 mLを加え、1時間（図1B、C）のためにワームは、室温でM9バッファーに飢えてみましょう。

3。短期的な連想記憶が（密集）トレーニング

短期的な連想記憶のアッセイのワークフローについては、図1Bを参照してください。

1. M9バッファー（セクション2）でシードされている60 mmの線虫の増殖培地の蓋の内側に10％ブタノン（95％EtOH中^{）（NGM）11}枚の縞2μLの餓死期間の終わりに500μLOP50 E.大腸菌 。
   注：短期および長期記憶のアッセイのための良い出発人口は、ワームの≥500μLです。複数の調整板は、訓練中に全人口をサポートするために、遺伝子型ごとに必要とされる。揮発性の化学薬品を取り扱う際には、唯一のそれらは他のすべての時間で閉じて残して、プレート、必要なときのふたを開きます。
2. 真空で飢えたワームの15 mLコニカルチューブからM9バッファー上清を取り除くとコンディショニングのプレートにワーム100〜200μLを適用するP1000 pipetmanを使用してください。
   注：調整プレートへの転送時にワームが急速にOP50食料源に到達できるよう、可能な限り多くのM9の液体を除去してみてください。ワームは、ピペットチップの内側に付着し、小さなボリュームをピペッティングすることにより保存することができます。
3. 1時間（図1B）を、室温で調節プレートをインキュベートする。
4. 15 mLコニカルチューブに〜1 mLをM9バッファーでプレートのワームを洗い流してください。ワームは、重力によって解決しましょう​​。チューブのM9のバッファがクリアされるまでは再び1 - 2X洗浄する。
   注意：セクションで説明されている穏やかな洗浄方法を使用します。2。同じ15 mLコニカルチューブは、セクション2から使用することができます。
5. 最終洗浄後、直ちにコンディショニング後（密集）食品-ブタノン協会の連合学習を真空でM9バッファー上清を除去、 および 1xをテストするための走化性アッセイのためのワームの人口（5節）の一部を使用（0分の時点）。
   学習インデックス（LI）= CI _0時間 - CI _素朴 。
6. OP50の500μL（プレートを保持）を接種した60 mmのNGMプレートにワームの残りの人口を移す。再び、人口を支えるのに十分な細菌が存在するようプレート当たりワーム100〜200μLを適用する。
   注：遺伝子型ごとに使用されるホールドプレートの数は、少なくともテストする短期的な連想記憶の時間点の数です。
7. 室温（図1B）で0.5、1、または2時間（短期連想記憶の時点）のためのポストコンディショニングのプレートをインキュベートする。
   注：野生型動物の短期連想記憶は、研修後2時間で終了します。タイムポイントは、異なる遺伝子型または条件に合わせて調整する必要があります。
8. 食品-ブタノン関連の短期的な連想記憶をテストするには、各時点の後、静かにM9バッファーで1 - 2X再び15 mLコニカルチューブにプレートからワームを洗って。走化性アッセイ（セクション5）のためのワームを使用してください。学習インデックス（LI）= CIの_{時間のポイント} - CI _素朴 。
   注：セクション2で説明されている穏やかな洗浄方法を使用します。各時点では、走化性アッセイで使用されていない余分なワームを破棄。

4。長期的な連想メモリ（間隔）トレーニング

長期的な連想記憶のアッセイのワークフローについては、図1Cを参照してください。

1. 第3節の手順3.1から3.2に従ってください。
2. 30分（図1C）、室温で調節プレートをインキュベートする。
3. セクション3の手順3.4に従ってください。
   注：30分の時間枠の内部に残るためには、〜25分でのトレーニング中にすべての洗浄を開始することができます。
4. 最終洗浄後、60 mmのNGMプレートをシーディングするために真空と転送ワームによってM9上清を取り除く。
   注意：ワームが飢えているので、遺伝子型ごとに複数のプレートの使用はこのステップで必要とされていません。
5. 30分（図1C）、室温で60 mmのNGMプレート上に飢える。
6. 15 mLコニカルチューブにM9バッファーでワームを洗ってください。 （ 遠心分離しないでください ）ワームは、重力によって解決しましょう。
   注：この時点でバッファ内に細菌が存在しないはずですが、遠心分離は、ワームの潜在的に有害な治療することができ、長期記憶の形成を混乱させる可能性があります。
7. 繰り返し7コンディショニングブロックの総数までは4.1から4.6を数回繰り返し、6飢えブロックが完了している（図1C）。 （代表的なタイムシートについては、表1を参照してください。）
8. ゆっくりとM9バッファーで1 - 2X再び15 mLコニカルチューブにプレートからワームを洗浄し。
9. 最終洗浄後、（0時間の時点）直後コンディショニング後（等間隔）7倍をテストするための食品-ブタノン協会の連合学習を走化性アッセイのためのワームの人口（5節）の一部を使用してください。学習インデックス（LI）= CI _0時間 - CI _素朴 。
10. OP50 1mLで播種された100mmのHGMプレートにワームの残りの人口を転送する（プレートを保持）。再び、人口を支えるのに十分な細菌が存在するようプレート当たりワーム100〜200μLを適用する。
    注：遺伝子型ごとに使用されるホールドプレートの数は、少なくともテストする長期的な連想記憶の時間点の数です。 100 mmのNGMプレートは、ポストコンディショニングプレートとして使用できますが、一つは少なくとも16時間ワームの人口をサポートするのに十分なOP50があることを非常に慎重でなければなりません。
11. 20℃（図1C）でポストコンディショニングの16のプレート24、および40時間を（長期的な連想記憶の時点）インキュベートする。
    注：野生型動物の長期連想記憶は、トレーニング後40時間で終了します。タイムポイントは、異なる遺伝子型または条件に合わせて調整する必要があります。
12. 食品-ブタノン協会の長期的な連想記憶をテストするには、静かに各時点の後にM9バッファーで1 - 2X再び15 mLコニカルチューブにプレートからワームを洗って。走化性アッセイ（セクション5）のためのワームを使用してください。学習インデックス（LI）= CIの_{時間のポイント} - CI _素朴 。
    注：セクション2で説明されている穏やかな洗浄方法を使用します。各時点では、走化性アッセイで使用されていない余分なワームを破棄。

5。走化性アッセイ

1. 走化性アッセイプレートを準備します。プレートの底部と両側（図2A）上のスポットでシーディングされていない 100mmのNGMプレートの底をマーク。
   注：少なくとも3つの遺伝子型ごとに複製は、統計的に有意な結果を得るために実行する必要があります。
2. 匂いで1 M NaN _3をのスポット1μLとコントロールスポット（図2B）。
   注：15分以上のアッセイを開始する前にこの麻痺剤を使用してプレートを見つける、またはNaN _3がスポットから離れて拡散され、動物が匂いやコントロールスポットに到達する前に、麻痺になるしないでください。ない穿刺寒天をワームがパンクした地域で穴を掘る。なぜならのNaN _3を適用_することに注意してください。
3. ワームは、スポット1μL、95％エタノール及び10％のブタノンのそれぞれは、上（図2C）は、マークアッセイプレート上で適切な箇所に（セクション7.2を参照）、いくつかのM9バッファーの洗浄（2節）後のコニカルチューブにセトリングしている間以前に発見のNaN 3の上。
   注：化学物質がワーム（5.4節）を追加する前に発見されている必要があります。スポットは、エタノールまたはブタノンを持っているかメモしてください。これらの揮発性の化学薬品を取り扱う際に、必要なときだけプレートの蓋を開き、それらは他のすべての回で閉じておくように注意してください。
4. 定住ワームのチューブからできるだけM9バッファーをできるだけ多く削除します。マークアッセイプレート（図2D）の起源に3X 5μLワーム（200〜400動物を）提供するプレカット先端（セクション7.3を参照）とP20 pipetmanを使用してください。
   注：プレコンディショニング飢えとメモリのアッセイ（セクション2-4）で使用するために15 mLコニカルチューブに残っているワームをキープ。ワームは、ワームの人口を節約してアッセイプレート上にワームでリリースされる液体の量を減少させるので、少ない量でプレートにワームを追加し、ピペットチップの内部に残ることでしょう。
5. 小さな点にキムワイプのコーナーをねじり、余分なM9バッファーをブロットにそれを使用。これは、アッセイプレート（図2E）にワームをリリースする予定です。
   注：ない穿刺キムワイプと寒天に注意してください、そうでなければワームは原点で穴を掘るなります。ブロッティング時にそれらがM9バッファーでキムワイプに引っ張られるように、一部のワームは、この段階で失われる可能性があります。ワーム（セクション6）をカウントするためのイメージングと解析を使用している場合は、原点からのワームをリリースする前に、イメージングステーションにプレートを取る。リリース後にすぐに原点にワームの画像は、アッセイプレートのために動物の総数を示すことになります。
6. 室温で1時間走化性アッセイプレートをインキュベートします。
7. 原点、エタノールでワームの数をカウントし、ブタノンのスポット（図2）、同様にアッセイプレート上でワームの総数。
   注：一般的には、NaN ₃で麻痺ワームは、スポットの〜1cmの範囲内になり、お互いに不利な多くの動物で、スティックストレートが表示されます。ワーム（セクション6）をカウントするためのイメージングと解析ソフトウェアを使用する場合は、起源、エタノール、およびブタノンスポットの画像を撮影する。ワームの総量の画像は、5.5節で撮影されている必要があります。ワームはまた、"手カウント"とすることができます。
8. "走指数"（CI）を計算します。 CI =（[（N _ブタノン ） - （nは_{エタノール} )]/[(合計- nの_起源 ）]。

6。画像解析によるカウントワーム

1. 走化性アッセイプレート上でワームのハイコントラスト白黒画像を撮影する（図3A、カメラのセットアップの詳細については、セクション7.4を参照）。走化性指数を計算するには、画像がブタノン、エタノールで必要、としている起源の分析の最後に走化性アッセイプレートのスポットだけでなく、ワームの総数（それらがから解放された直後の原点にワームの写真アッセイの先頭にM9バッファー、5.5項）。
   注：各スポットに約2 cmの半径についてカバーする走化性アッセイプレートの画像は一般的に各スポットのために動物のすべてを取り込む。
2. 1つの時点（例えばナイーブ、0時間、等）のすべての試験のためのファイルが適切な名前の、一つのフォルダに含まれていることを確認してください。
3. 各走化性のプレートのためのファイルは、そのように名前を付ける必要があります。。。。。しかし＃PNG（ブタノンのスポット、裁判＃）、oriを＃PNG（起源、トライアル＃）、ETH＃PNG（エタノールのスポット、裁判＃）、TOT＃PNG （合計、トライアル＃）。 （たとえば、2つの試験が次のファイルが存在すると同じフォルダ内に、時間の点のために実行された場合：but1.png、eth2.png、eth1.png、but2.png、ori1.png、ori2.png、tot1 。PNG、tot2.png）
4. オープンなMATLAB（7.5節を参照）。
5. MATLABウィンドウの上部にある"カレントディレクトリ"ラインで、フォルダをブラウズし、"count_worms_v0.5.3"フォルダ（補助情報として利用可能なM -ファイル）を選択します。
6. "コマンドウィンドウ"で、タイプ"count_worms_directory（）。" Enterキーを押します。
   注：デフォルトのワームのサイズは、このコマンドのために最小10、最大80ピクセルです。特定の遺伝子型や発生段階に基づいてこれを調整するには、タイプ"count_worms_directory（'MinSizeの'、10、"MAXSIZE"、80）"とそれに応じて画素数を変更する。
7. プロンプトが表示されたら、分析する画像のフォルダを選択します。
   注：画像のフォルダは1つだけ一度に分析することができます。
8. 分析されるフォルダ内の各画像は、既に設定されたしきい値をポップアップ表示されます、そして粒子が（図3A）を選択。目を削除するワームではない選択された粒子上の四角形のツールをドラッグしますEM。イメージが終了したら、Escキーを押す。
9. フォルダ内のすべての画像がチェックされた後、4つのカラムには、コマンドウィンドウに表示されます：（1）画像の名前（例but1）、（2）常に"[1]、"（3）によって計算されたものワームの平均画素サイズをプログラムの特定の画像を、そして画像になるように計算されたワームの（4）数。
10. このプログラムが実行されれば、それはそれだけで分析している画像のフォルダに2。csvファイルを（Excelスプレッドシートとして開くことができます）デポジットされます。 "worm_counts_stats"ファイルは、コマンドウィンドウ（6.9節）に見られる出力の列を提供します。 ;のワームの数（2）ただし、（3）ETH、及び（4）織りスポット、およびワームの（5）総数（1）試験番号："worm_counts_summary"ファイルには、5つの列を提供します。

7。材料のメモ

1. 100ミリメートルの高成長のメディアを準備するには（HGM）プレート（第1）：700 mLの蒸留水で3グラムのNaCl、20グラムバクト、および30gバクト寒天を溶かす。蒸留水で1Lにボリュームをもたらす。 65℃に、クールな寒天をオートクレーブし、エタノールで5 mg / mLのコレステロールを4mLを追加した後、1 mLの1 M CaCl _2で 、1 M MgSO _4を 、そして1 M KPO ₄液（pH = 6.0）25 mLの各。
2. 高い割合のエタノールが結果に影響を与えることができる精製プロセスからの不純物を含んでいる傾向があるとして95％EtOHを、使用されています。それは、アッセイを実行する新鮮ごとに数回、最大10％のブタノン（95％EtOH中）株を作成することをお勧めします。
3. P20のヒントは、ワームが損傷を受けることなく装着できるようにするために十分な大きさの穴を作成するためにカットオフ数ミリメートルを持っている必要があります。 P1000のヒントはすでにワームの穴に装着できるように十分な大きさの穴を持っている。
4. マーフィーラボの走化性アッセイプレートのイメージングステーション（図3B）は、ブームスタンドに取り付けられた変倍レンズとFireWireカメラが含まれています。バックライトは、走化性アッセイプレートを下から照らされることを可能にするガラスの上部（図3C）、とカスタムイメージングプラットフォームの下にスタンドの下部に配置されます。 "計測と自動化"ソフトウェア（ナショナルインスツルメンツ）が画像を取り込むために使用されます。設定このイメージングステーションのための材料は^12日以前に発行されたものと類似しており、特定の試薬 ​​と機器の表に記載されています。

8。代表的な結果：

ブタノンが0.2（図4A）の周りには10％が野生型ワームの典型的なナイーブな走化性指数^（CI）6密集（1X）またはスペース（7倍）のトレーニングは、一般的に一度0.7から0.8にするには、0（図の走化性指数を増加させる学習インデックス（LI =訓練されたCI与えるために4A、CD） - 。〜0.6の素朴なCIを^）6密集または間隔のトレーニングで発生する学習は非常に堅牢です。 0.5未満のLIは、典型的にナイーブな走化性アッセイに問題がある場合に発生し、動物が0.3以上の素朴なCIを持っている。環境臭気はまた、素朴なCIを増やすことができます。ワームは飢えすぎたり栽培のプレート上に混んで漂白し、アッセイの開始までの間、またはワームが洗浄の間でM9バッファーに長すぎて座って飢えを開始しているため、通常、これが発生します。飢えたワームは10％のブタノン、はるかに高いナイーブCI（図^4B）。6私たちは、素朴な走化性に関する問題は、一般的に改良されたワームのケアと培養すると解決されていることが判明している。

これらのアッセイにおけるメモリの持続時間は、学習インデックス= 0、それがすぐにナイーブなレベルに戻るには、トレーニング後の走化性のインデックスまでの時間です。野生型の動物では、短期的な連想記憶は、一般的に、密集したトレーニング後1時間で減少し始め、約2時間持続し、転写因子CREB（図4C）とは無関係です^。6長期連想記憶は、一般的に始まっていない。大幅に等間隔のトレーニング後16時間まで減少し、40時間まで続く、と（図4D）CREB依存的な⁶長期連想記憶は、いくつかのインスタンスでその可能性を最大限に到達しない可能性があります：（1）ワームは、十分を持っていないOP50 E. 30分のコンディショニング期間中の大腸菌は 、（2）細菌は飢餓の期間中にM9のバッファに残って、または（3）ワームは、アッセイ（例えば、ワームがチューブの側面にピペッティングした）中に破損している。

結果は一般的に4つ以上の走化性アッセイの試験が1時点遺伝子型ごとに実行されるときに統計的に有意である。 6つを実行すると、遺伝子型ごとに複製されます一般的に処理するようにあまりにも多くになることなく、非常に重要な結果が得られますが、初心者は3つだけがレプリケートで開始することをお勧めします。一般的に、時間で2〜3遺伝子型または条件での作業は、これらの学習と記憶アッセイの使用経験がある人にとって快適である。

走化性アッセイプレート上に手カウントワームは非常に時間がかかる場合、実験や研究室の仲間の間で変動を加えることができる、と分析して、私時にもバイアスが生じることがありますデータをnterpreting。画像解析（第6節）で数えワームは、研究室間でのデータ収集と解析を標準化し、平均して、手のカウントに必要なことの1 / 5〜経験豊かな研究室のメンバーのデータの分析時間を削減。 Count_wormsソフトウェアによって決定されるものに手動ワームのカウントを用いて計算した走化性の指標を比較するとき、我々は3.07（± 1.19）​​％の平均誤差を見つける。

日1
タイム	ステップ
午前9時00分	1時間はM9バッファーで飢える 素朴な走化性アッセイを開始
10時	条件＃1（食とブタノンと60 mmのNGMプレート）、30分 エンド素朴な走化性アッセイ
午前10時30分	30分、第1位（60 mmのNGMプレート）を飢えさせる
11時00分	状態＃2、30分
11：30	飢える＃2、30分
午前12時	条件＃3、30分
午前12時30分	＃3、30分を飢えさせる
午前一時	状態＃4、30分
1時半	第4位、30分を飢えさせる
2：00	条件＃5、30分
2時30分	＃5、30分を飢えさせる
3時	状態＃6、30分
3時30分	、30分に＃6を飢えさせる
午前4時	条件＃7、30分
4時30分	0時間走化性アッセイを始める 16〜40時間のためのプレートを保持するために、残りのワームを転送する
午前5時30分	エンド0時間走化性アッセイ
日2
タイム	ステップ
午前8時30分	16時間走化性アッセイを始める
午前9時30分	最後の16時間走化性アッセイ

表1。長期的な連想記憶のアッセイの代表的なスケジュール。この例では、アッセイは、餓死、1時間で午前9時から1日に始まります。ワームは、七回を条件付けされるまで30分の条件と期間を飢えが交互に。走化性アッセイは、トレーニングの始まり（ナイーブ）と終わり（0時間）で実行されます。最初から最後まで、実行時の合計は8.5時間です。ホールドプレート上のワームは16から40時間のトレーニング後、2日目に始まるブタノンへの走化性のためにテストされています。

図1短期と長期の連想記憶のアッセイのワークフロー。 （）アッセイが行われる日に至るまでの準備のタイムラインを推奨。 （B）短期連想記憶のアッセイ：飢餓ワームが1時間エアコンと走化性アッセイを経由して1倍の学習（0分）については、直ちにテスト、または調整後0.5、1、または2時間のために食物と一緒に保持板上に転写されています。 （C）長期連想記憶のアッセイ：飢餓、動物は16〜40時間の訓練後の学習やLTAMのためにテストされる前にコンディショニング/飢えに苦しむ中、第7研修ブロックを受け取る。

図2。走アッセイのセットアップ。走化性アッセイプレートの（A）の回路図。小さなスポットは、原点（下）とプレート上ブタノンおよびEtOH（左と右）スポットをマークするために定規または他の案内装置の助けを借りてプレートに追加されます。 （B）1μLのNaN _3は、ブタノンおよびEtOHスポットに追加されます。 （C）1μLの10％ブタノン及び95％E​​tOHのそれぞれは、プレートの左側または右側の点々追加されます。 （D）M9バッファーに懸濁して200から400ワームは、プレートの起源に追加されます。 （E）点にねじれてキムワイプはアッセイプレートの上にM9のバッファとリリースのワームを吸収するために使用されます。

図3。画像解析でカウントワーム。 "count_worms_v0.5.3"画像の粒子の選択ウィンドウの（）の例。プログラムは、オリジナルのハイコントラスト白黒の画像（左）が自動的に閾値画像（真ん中）でウィンドウをポップアップして開きます。長方形ツールはこのようなアッセイプレートマーク（1）、プレートのエッジ（2）、または寒天穿刺（3）のような望ましくない非ワーム"粒子を、"ハイライト表示し、除去するために使用することができます。マーフィーラボ走化性アッセイのイメージングステーションの（B）画像。走化性アッセイプレートは、分析に必要な高コントラストな画像を作成するために下から照らされている。カスタムメイドの（C）回路図走化性のイメージングステーションで使用されているイメージングプラットフォーム。

図4代表的な連合学習と記憶の結果。密集した時に10％のブタノンの増加（1倍）のトレーニングに、野生型ワームの（A）単純な走化性の指数。学んだ協会は、食品（OP50 大腸菌 ）とブタノンのペアリングが必要です。バー上の数字は、"学習のインデックスを"（ - CI _{ナイーブに} LIが= CITrained）を表します。ワームが16時間に飢えているとき（B）10％ブタノンへの野生型のナイーブの走化性が大幅に増加している。 ADパネルがカウフマンらから適応されています^{。、2010。6（C）}野生型短期連想記憶は、約2時間持続し、転写因子CREBとは無関係です。 （D）野生型の長期的な連想記憶は、約40時間持続し、CREB依存性である。

補足情報

• "imoverlay.m"ファイルはこちら 。
• "count_worms_image.m"ファイルはこちら 。
• "count_worms_directory.m"ファイルはこちら 。
• "cellwrite.m"ファイルはこちら 。

Discussion

C.線虫嗅覚連合学習と記憶のアッセイは、ここで集中学習、等間隔学習、短期記憶、長期記憶のプロセスを区別して提示。これらのアッセイは、自分の環境の^1,2の食品や薬品臭いを感知し、2つの間に正の関連を形成するためにワームの能力に依存している^。6したがって、アッセイは、動物の開始人口の飢餓に非常に敏感であるため、最適なケアを行う必要がありますワームは、よくトレーニングの前後に供給されるように注意する。単一の密集した訓練は、短期的な連想記憶をもたらします。コンディショニング期間と間隔の訓練パラダイムの増加数は 、C言語の長期的な連想記憶を得るために重要です。それは他の生物にそのままエレガンス ^。6,8は、おそらく、このアッセイは異なるエアコンと無条件刺激の間の関連の長期記憶を作り出すに変更することができます。

私たちの連合学習と記憶のアッセイは、加齢や遺伝的変異動物に野生型の学習や記憶能力を比較するために使用することができます。例えば、野生型のワーム、学習が低下インスリンシグナル伝達と動物の加齢に伴って長く維持され、そして学習と記憶がカロリー制限の動物の加齢に伴って長く維持され、老朽化の連合学習と長期的な連想記憶の能力の両方が減少し⁶時間これらのアッセイはまた、RNAi処理またはCの薬理学的操作に適しているエレガンス 。例えば、DAF - 2のRNAiによるワームの治療が向上、短期と長期の連想記憶、逆に、間隔の訓練中の遺伝子の転写と薬剤とのタンパク質合成（アクチノマイシンDとシクロヘキシミド、それぞれ）の閉塞は、長期記憶の形成を混乱させる。 ⁶

短い、連合学習を区別し、テストする機能の長期的な記憶は、すべての動物の生存に不可欠なプロセスであり、そしてそれはそのパブロフ協会のメモリに関与する分子機械の多くは、哺乳類へのワームから保存されて表示されます^。6これらの嗅覚アッセイを用いて長期と長期記憶は C になりますメモリのさらなる研究のための優れたシステムは、 虫 、そして学習と人間の記憶の喪失につながる神経変性のプロセスへの洞察を提供することがあります。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Azide		Fisher Scientific	S227	Prepare 1 M concentration in distilled water
Ethyl Alcohol 190 Proof		Pharmco-Aaper	DSP-CT-18	>95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays
2-Butanone 99+%		Acros	14967-0010
Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera		Edmund Optics	NT56-683
InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial		Edmund Optics	NT56-202
Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator		Edmund Optics	NT55-718
8” x 8” Backlight		Schott Fostec	A08927
Standard Boom Stand		Edmund Optics	NT54-120
3/4” Post Adaptor for Boom Stands		Edmund Optics	NT54-124
Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate		Edmund Optics	NT54-122