En poleret og forstærket tyndt befolket kranie Window for langsigtet Imaging af Mouse Brain

Summary

Vi præsenterer en fremgangsmåde til dannelse af en billeddannende vindue i mus kraniet, der strækker sig millimeter og er stabil i måneder uden inflammation i hjernen. Denne fremgangsmåde er velegnet til langsgående studier af blodgennemstrømning, cellulære dynamik, og celle / vaskulær struktur med to-foton-mikroskopi.

Abstract

In vivo billeddannelse af cortical funktion kræves optisk adgang til hjernen, uden afbrydelse af intrakranial miljøet. Vi præsenterer en fremgangsmåde til dannelse af en poleret og forstærket fortyndet kraniet (porte) vinduet i mus kraniet, som spænder over flere millimeter i diameter og er stabil i måneder. Kraniet fortyndes til 10 til 15 um i tykkelse med en håndholdt boremaskine til at opnå optisk klarhed, og derefter overlejret med cyanoacrylat lim og et dækglas til: 1) tilvejebringe stivhed, 2) inhibering af fornyet knoglevækst og 3) reduktion af lysspredning fra uregelmæssigheder på knogleoverfladen. Da kraniet ikke er overtrådt, er enhver betændelse, der kan påvirke processen ved at blive undersøgt stærkt reduceret. Billeddannelse dybder på op til 250 um under den kortikale overflade kan opnås ved anvendelse af to-foton laser scanning-mikroskopi. Dette vindue er velegnet til at studere cerebral blodgennemstrømning og cellulær funktion i både bedøvede og vågen præparater. Det yderligere giver oplighed for at manipulere celleaktivitet under anvendelse optogenetics eller at afbryde blodstrømmen i målrettede fartøjer ved bestråling af cirkulerende fotosensibilisatorer.

Protocol

1. Forberedelse til operation ⁱ

1. Rengøres kirurgiske værktøjer ved sonikering i en blanding af Maxizyme og kirurgisk mælk i en ultralydsrenser. Autoklaven kirurgiske værktøjer, før hvert eksperiment.
2. Sørg for, at alle nødvendige reagenser og engangsartikler er til rådighed. En liste af reagenser og engangsartikler er tilvejebragt i tabel 2. Reagenser og engangsartikler, der kommer i kontakt med udsatte væv, skal være sterile, når det er muligt.
3. Induktion af anæstesi.......

Discussion

To-foton billeddannelse gennem et HAVNE vindue kræver transmission gennem den indsnævrede ben og dura, som dæmper laserlyset og tilføjer optiske aberrationer på større dybder ^8. Til trods for denne ulempe kan billeddannelse dybder op til 250 um under pial overflade opnås med 900 nm excitation. Større billeddannelse dybder kan i princippet være muligt med længere excitationsbølgelængder ^13. En væsentlig fordel ved denne fremgangsmåde er fraværet af kortikale inflammation, der kan eksi.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agent	Route levering	Dosis for mus	Varighed	Noter	Kilde	Ref Ref
Pentobarbital (Nembutal)	IP	90 ug / g	15-60 min	Smal sikkerhedsmargin. Arbejdet op til korrekt dosering af anæstesi langsomt. Supplement 10% af induktion dosis som påkrævet.	036093; Butler Schein	7
Ketamin (Ketaset) blandet med xylazin (Anased)	IP	60 ug / g (K) 10 ug / g (X) (blanding i samme sprøjte)	20-30 minutter	Xylazin er co-injiceres som en muskelafslappende og smertestillende. Supplere kun Ketamin 50% af induktion dosis som påkrævet.	(K) 010.177, (X) 033.198; Butler Schein	7
Isofluran (Isothesia)	Indånding	4% betyder alveolære koncentration (MAC) til induktion; 1-2% MAC til vedligeholdelse	4-6 timer.	Tilvejebragt i en blanding af 70% oxygen og 30% dinitrogenoxid. Langvarig anæstesi fører til langsom bedring.	029403; Butler Schein	26

KONTO	SELSKABET	katalog # / MODEL
Betadine	Butler Schein	6906950
Buprenorphin (Buprenex)	Butler Schein	031919
Fluoresceinisothiocyanat dextran, 2 MDa molekylvægt	Sigma	FD2000S
Isopropylalkohol	Fisher	AC42383-0010
Ringer-lactatopløsning	Butler Schein	009846;
Lidocainopløsning, 2% (v / v)	Butler Schein	002468
Saline	Butler Schein	009861
Kirurgisk Mælk	Butler Schein	014325
Texas Red dextran, 70 kDa molekylvægt	Invitrogen	D1864
Maxizyme	Butler Schein	035646
Engangsartikler
Carbide grater, 1/2 mm dysestørrelse	Gode ​​Science Tools	19007-05
Cottoned tip applikatorer	Fisher Scientific	23-400-100
Dækglas, no. 0 tykkelse	Thomas Scientific	6661B40
Cyanoacrylat lim	ND Industries	31428 H04308
Gas duster	Newegg	N82E16848043429
Grip cement pulver	Dentsply	675571
Grip cement opløsningsmiddel	Dentsply	675572
Insulin sprøjte 0,3 ml volumen med 29,5 kanyle	Butler Schein	018384
Møtrik og bolt at fastgøre hovedet	Digikey	Nut, H723-ND, bolt, R2-56X1/4-ND
Opthalmisk salve	Butler Schein	039886
Skalpelblade	Fisher Scientific	12-460-448
Skruer, selvskærende # 000	JI Morris Company	FF000CE125
Silikone akvarium fugemasse	Perfecto Manufacturing	31001
Tinoxid pulver	Mama 's Mineraler	EQT-TINOX
UDSTYR
Glas skriftklog	Fisher Scientific	08-675
Dissektionsmikroskop	Carl Zeiss	OPMI-1 FC
Elektrisk drevne boremaskine	Foredom eller Osada	K.1020 (Foredom) eller EXL-M40 (Osada)
Elektrisk barbermaskine	Wahl	Series 8900
Pincet, Dumont no. 55	Gode ​​Science Tools	11255-20
Feedback reguleret varmepude	FHC	40-90-8 (rektal termistor, 40-90-5D-02 hspise pude, 40-90-2-07)
Isofluran fordamper	Ohmeda	IsoTec4
Pulsoximeter	Starr Life Sciences	MouseOx
Skruetrækker, miniature	Garret Wade	26B09.01
Stereotaktisk ramme	Kopf Instruments	Model 900 (med musen anæstesi maske og ikke-brud øre barer)
Kirurgiske sakse og stump-ende-	Gode ​​Science Tools	14078-10
Ultrasonic renere	Fisher Scientific	15-335-30