Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

Summary

Wir stellen eine Methode, um ein bildgebendes Fenster in der Maus, die Schädel Millimeter überspannt und ist seit Monaten ohne Entzündung des Gehirns stabil zu bilden. Diese Methode wird auch für longitudinale Studien des Blutflusses, Zelluläre Dynamik und Zell / vaskuläre Struktur mit zwei-Photonen-Mikroskopie geeignet.

Abstract

In-vivo-Bildgebung der kortikalen Funktion erfordert optische Zugang zum Gehirn ohne Störung des intrakraniellen Umwelt. Wir stellen eine Methode, um eine polierte und verstärkte ausgedünnt Schädel (Ports) Fenster in der Maus Schädel, die mehrere Millimeter im Durchmesser überspannt und ist über Monate stabil zu bilden. Der Schädel auf 10 bis 15 um in der Dicke mit einer Hand gehalten Bohrer optische Klarheit zu erreichen verdünnt und dann mit Sekundenkleber und ein Deckglas zu überlagern: 1) für Steifigkeit, 2) zu verhindern Knochenwachstum und 3) zu reduzieren Lichtstreuung von Unregelmäßigkeiten auf der Knochenoberfläche. Da der Schädel nicht verletzt ist, wird jede Entzündung, die den Prozess beeinflussen könnten, untersucht stark reduziert. Imaging Tiefen von bis zu 250 mu m unterhalb der kortikalen Oberfläche kann mit Hilfe der Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie werden. Dieses Fenster eignet sich gut zur Hirndurchblutung und zelluläre Funktion in beide betäubt und wach Vorbereitungen zu studieren. Es bietet darüber hinaus den OPPortunity zu manipulieren Zellaktivität mit Optogenetik oder um den Blutfluss in ausgewählten Behältern durch Bestrahlung der zirkulierenden Photosensibilisatoren stören.

Protocol

1. Vorbereitung für Chirurgie ^I

1. Reinigen Sie die chirurgischen Instrumente im Ultraschallbad in einer Mischung aus Maxizyme und Chirurgische Milch in einem Ultraschallreiniger. Autoklavieren chirurgische Instrumente vor jedem Experiment.
2. Stellen Sie sicher, dass alle notwendigen Reagenzien und Verbrauchsmaterial zur Verfügung stehen. Eine Liste von Reagenzien und Verbrauchsmaterial ist in Tabelle 2 bereitgestellt. Reagenzien und Einwegartikel, die in Kontakt mit dem freiliegenden Gewebe.......

Discussion

Zwei-Photonen-Bildgebung durch eine Ports Fenster erfordert die Übertragung durch den ausgedünnten Knochen und Dura, welches das Laserlicht dämpft und fügt optischen Aberrationen in größeren Tiefen ^8. Doch trotz dieses Nachteils kann bildgebenden Tiefen bis zu 250 mu m unterhalb der Pia-Oberfläche mit 900 nm Anregung erreicht werden. Größere Tiefen Bildgebung kann im Prinzip möglich sein, mit mehr Anregungswellenlängen ^13. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode ist das Fehlen von kortik.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agent	Route der Lieferung	Dosis für die Maus	Dauer	Hinweise	Quelle	Ref
Pentobarbital (Nembutal)	IP	90 ug / g	15-60 min	Schmale Sicherheitsmarge. Arbeiten Sie bis zu richtigen Dosis der Narkose langsam. Zuschlag 10% der Induktionsdosis wie erforderlich.	036093; Butler Schein	7
Ketamin (Ketaset) mit Xylazin (Anased) gemischt	IP	60 ug / g (K) 10 ug / g (X) (Mischung in derselben Spritze)	20-30 min	Xylazin wird als Muskelrelaxans und Analgetikum co-injiziert. Zuschlag nur Ketamin bei 50% der Induktion Dosis erforderlich.	(K) 010.177, (X) 033.198; Butler Schein	7
Isofluran (Isothesia)	Inhalation	4% bedeuten alveolare Konzentration (MAC) für die Induktion; 1-2% MAC für die Wartung	06.04 Uhr.	Bildquelle in einer Mischung aus 70% Sauerstoff und 30% Distickstoffmonoxid. Längerer Betäubung führt zur Genesung verlangsamen.	029403; Butler Schein	26

ITEM	UNTERNEHMEN	Catalog # / MODELL
Betadine	Butler Schein	6906950
Buprenorphin (Buprenex)	Butler Schein	031919
Fluoresceinisothiocyanat Dextran, 2 MDa Molekulargewicht	Sigma	FD2000S
Isopropylalkohol	Fischer	AC42383-0010
Ringer-Laktat-Lösung	Butler Schein	009846;
Lidocain-Lösung, 2% (v / v)	Butler Schein	002468
Saline	Butler Schein	009861
Chirurgische Milk	Butler Schein	014325
Texas Red Dextran, 70 kDa Molekulargewicht	Invitrogen	D1864
Maxizyme	Butler Schein	035646
EINWEGARTIKEL
Hartmetallfräser, 1/2 mm Düsengröße	Fine Science Tools	19007-05
Cottoned Spitze Applikatoren	Fisher Scientific	23-400-100
Deckglas, nein. 0 Dicke	Thomas Scientific	6661B40
Sekundenkleber	ND Industries	31428 H04308
Gas-Staubtuch	Newegg	N82E16848043429
Grip Zementpulver	Dentsply	675571
Grip Zement Lösungsmittel	Dentsply	675572
Insulinspritze, 0,3 ml Volumen mit 29,5 Gauge-Nadel	Butler Schein	018384
Mutter und Schraube, um den Kopf zu sichern	Digikey	Nuss-, H723-ND, Bolzen, R2-56X1/4-ND
Ophthalmische Salbe	Butler Schein	039886
Skalpellklingen	Fisher Scientific	12-460-448
Schrauben, selbstschneidend # 000	JI Morris Company	FF000CE125
Silikon-Dichtstoff Aquarium	Perfecto Fertigung	31001
Zinnoxidpulver	Mamas Minerals	EQT-TiNOX
EQUIPMENT
Glas-Schreiber	Fisher Scientific	08-675
Seziermikroskop	Carl Zeiss	OPMI-1 FC
Elektrische Bohrmaschine	Foredom oder Osada	K.1020 (Foredom) oder EXL-M40 (Osada)
Elektrische Rasierer	Wahl	Serie 8900
Pinzetten, Dumont-Nr. 55	Fine Science Tools	11255-20
Ihre Meinung geregelten Heizkissen	FHC	40-90-8 (rektal Thermistor, 40-90-5D-02; hessen-Pad, 40-90-2-07)
Isofluran Verdampfer	Ohmeda	IsoTec4
Pulsoximeter	Starr Life Sciences	MouseOx
Schraubendreher, Miniatur	Garret Wade	26B09.01
Stereotaktischen Rahmen	Kopf Instruments	Modell 900 (mit der Maus Narkosemaske und Nicht-Bruch Ohr Bars)
Chirurgische Schere, stumpfen Ende	Fine Science Tools	14078-10
Ultraschallreiniger	Fisher Scientific	15-335-30